複数の蛍光プローブを用いた機能性RNA分子のモーションキャプチャー

使用多个荧光探针对功能性 RNA 分子进行运动捕获

基本信息

批准号：
14658222
负责人：
横川隆志
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

昨年度、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を利用してRNAの構造変化が観察できるか確かめるために結晶構造が明らかとなっている酵母フェニルアラニンtRNA分子のDループの17番目に4-チオウリジンを、Tループの57番目にアミノヘキシルアデノシンを導入したRNAを分子整形法により作製した。この蛍光RNAはMg^<2+>を含む未変性の条件下と尿素中の変性条件下で蛍光スペクトルが変化したが、蛍光RNAの回収率が低く、しかもアミノアシル化活性が認められないRNAであった。そこで今年度は回収率の向上を期待して、4-チオウリジンアミダイトを購入し、RNA合成機を利用して4-チオウリジンを含むtRNAの半分子を化学合成し、それをつなぎ合わせる戦略を取ることにした。しかし、4-チオウリジンを含むRNAの合成収率が非常に低く、化学合成されたRNAから4-チオウリジンを含むtRNA分子の作製は断念せざるをえない状況である。現在、ハンマーヘッドリボザイムとT7RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写法によって任意のRNAを作製する手法を構築中である。また同時に、4-チオウリジン3リン酸をT7 RNAポリメラーゼの基質として加えることで、RNA分子内のランダムな部位に4-チオウリジンを導入して、そこに蛍光残基を導入した蛍光RNA分子を作製することを行っている。ここから、活性が認められる分子をスクリーニングすることで、構造探索蛍光RNA分子を効率的に作製することが可能となる。

去年，为了确认使用荧光共振能传递（FRET）是否可以观察到RNA的结构变化，RNA是通过使用4-硫代氨酸在酵母苯丙氨酸TRNA分子的D循环的第17位，通过分子成型产生的RNA，以及在57th位置的57th位置处产生的。该荧光RNA在天然Mg^<2+>下改变了尿素的变性条件，但它是一个RNA，其恢复速率较低，没有观察到氨基酰化活性。因此，今年，为了提高恢复率，我们决定购买4-硫岛胺胺，并使用RNA合成器化学合成一半的含有4-硫氨酸的tRNA，然后采用一种将它们一起缝合在一起的策略。然而，含有4-硫代氨酸的RNA的合成产率非常低，并且必须放弃含有化学合成的RNA的4-硫代氨酸的tRNA分子的产生。当前，我们目前正在使用锤头核酶和T7 RNA聚合酶在体外转录来生成任意RNA的方法。同时，添加4-硫岛3-磷酸盐作为T7 RNA聚合酶的底物，并将4-硫代氨酸引入RNA分子内的随机位点中，并在其中引入荧光残基来产生荧光RNA分子。从这里开始，通过筛选活性识别的分子，可以有效地产生结构探索的荧光RNA分子。