複数の蛍光プローブを用いた機能性RNA分子のモーションキャプチャー

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昨年度、蛍光共鳴エネルギー転移(FRET)を利用してRNAの構造変化が観察できるか確かめるために結晶構造が明らかとなっている酵母フェニルアラニンtRNA分子のDループの17番目に4-チオウリジンを、Tループの57番目にアミノヘキシルアデノシンを導入したRNAを分子整形法により作製した。この蛍光RNAはMg^<2+>を含む未変性の条件下と尿素中の変性条件下で蛍光スペクトルが変化したが、蛍光RNAの回収率が低く、しかもアミノアシル化活性が認められないRNAであった。そこで今年度は回収率の向上を期待して、4-チオウリジンアミダイトを購入し、RNA合成機を利用して4-チオウリジンを含むtRNAの半分子を化学合成し、それをつなぎ合わせる戦略を取ることにした。しかし、4-チオウリジンを含むRNAの合成収率が非常に低く、化学合成されたRNAから4-チオウリジンを含むtRNA分子の作製は断念せざるをえない状況である。現在、ハンマーヘッドリボザイムとT7RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写法によって任意のRNAを作製する手法を構築中である。また同時に、4-チオウリジン3リン酸をT7 RNAポリメラーゼの基質として加えることで、RNA分子内のランダムな部位に4-チオウリジンを導入して、そこに蛍光残基を導入した蛍光RNA分子を作製することを行っている。ここから、活性が認められる分子をスクリーニングすることで、構造探索蛍光RNA分子を効率的に作製することが可能となる。