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非天然アミノ酸を認識するアミノアシルtRNA合成酵素の創製

创建识别非天然氨基酸的氨酰基-tRNA 合成酶

基本信息

批准号：
12780507
负责人：
横川隆志
金额：
$ 1.15万
依托单位：
Gifu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
2000
资助国家：
日本
起止时间：
2000 至 2001
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究で作製した酵母チロシルtRNA合成酵素(TyrRS)の43位のチロシン残基をグリシンに置換した変異体(Y43G)は野生型のTyrRSが全く認識しない3-ヨードチロシンをtRNAに受容させることができる。そこで、Y43Gがその他のチロシンアナログを認識できるかどうかを、酸性PAGE法によって網羅的に解析した。その結果、多くの3-置換チロシンアナログを認識できることが示された。特筆すべきは光化学反応性の3-アジドチロシンをtRNAに受容できることである。これを生体外タンパク質系でタンパク質に部位特異的に導入させることができれば、他タンパク質との相互作用をたやすく解析することが可能になると考えられる。次に種々のチロシンアナログの中でY43Gのもっともよい基質であるDOPAをタンパク質に導入させることを試みた。もし、Y43GがサプレッサーtRNAに対して触媒的に働けば、部位特異的に、しかも効率よくDOPAをタンパク質に導入させることができるはずである。大腸菌の生体外タンパク質合成系に^14Cで標識されたDOPAを加え、モデルタンパク質であるGreen Fluorescent Protein(GFP)を合成させたところ、放射能の取り込みは見られなかった。しかし、GFPのアンバー変異遺伝子、アンバーサプレッサーtRNA、Y43Gと[^14C]DOPAを加えた場合には、GFPに放射能が取り込まれたことが観察された。このことは、GFP遺伝子のアンバー部位に特異的に[^14C]DOPAが取り込まれたことを示している。本研究では、アミノアシルtRNA合成酵素を改変し非天然アミノ酸をtRNAに受容させ、タンパク質に部位特異的に導入することを一つの目標にしており、上記の結果から、それを達成できたと考えられる。

In this study, we constructed a mutant (Y43G) at position 43 of the yeast tRNA synthetase (TyrRS), which was fully recognized as a 3-terminal variant of TyrRS. Y43G is a new type of protein. It can be used to analyze the protein by acid PAGE The results show that there are many 3-substitution mutations. A special photochemical reaction occurs when the tRNA is activated. The interaction between the two substances in vitro is analyzed. Y43G is the first to be introduced into the world. Y43G is the first to introduce DOPA into the system. E. coli in vitro protein synthesis system, 14C identification, DOPA addition, Green Fluorescent Protein(GFP) synthesis, radioactive energy extraction. GFP is the most powerful source of radioactivity in the world. The GFP gene is located in a region specific to [^14C]DOPA. In this study, we investigated the effects of site-specific introduction of non-natural amino acid tRNA synthase on the synthesis of tRNA.