相同性の低いファミリー酵素間でいかにして機能性の高いキメラ酵素を作るか

如何在低同源性家族酶之间创建高功能嵌合酶

• 批准号: 18658043
• 负责人: 大西 浩平
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Kochi University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18658043/
• 关键词: 酵素; 進化; バイオテクノロジー

既存タンパク質の部分配列を混ぜ合わせたキメラタンパク質ライブラリーの作製は、相同性の高いファミリー酵素間で行われてきた。相同性の低いファミリータンパク質(酵素)同士からでも、効率的にキメラ酵素を作り出すための手法を開発することを目的として研究を行っている。FAD依存のオキシドリダクターゼファミリーの中で、ベンゼン環を持つ化合物への水酸基導入に関与した性質の異なる2種類の酵素(相同性30%以下)をモデル酵素として用いた。1.異なるベクター上にクローン化した2種類のオキシドリダクターゼファミリー遺伝子(M.loti MAFF303099 ubiHとP.putida PpG7 nahG)の間で、我々が開発したin vivoシャフリングを利用して相同組換えを行った。相同性の高いbphC間でのin vivoシャフリングと違ってキメラ遺伝子の形成効率が著しく低いことが明らかとなった。また、得られたキメラ遺伝子の塩基配列を調べたところ、いずれかの親酵素遺伝子と同じ配列を持つものが大部分であった。この原因については不明であるが、従来行ってきたtwo-way ligationの代わりにthree-way ligationによって直鎖上DNAの作成を行った。しかしながら、キメラ遺伝子の割合を上昇させることはできなかった。2.得られたキメラ遺伝子を活性測定のための大腸菌HMS174に導入し、酵素活性を親酵素であるMHPC、 salicylate hydroxylaseの基質である5-ヒドロキシニコチン酸、サリチル酸を用いて測定した。キメラ酵素の評価系として、プレートリーダーと96穴マイクロタイタープレートを利用したハイスループット系を開発した。細胞抽出液に5-ヒドロキシニコチン酸、サリチル酸のそれぞれを加え、NADHの減少で測定したMHPC、salicylate hydroxylase活性の割合を指標にキメラ酵素を評価した。いずれも活性が検出されないか親酵素に比べて著しく低いものであった。

Some of the existing quality components are mixed, and some of the quality components are mixed. The same low level of activity, high activity, low activity, FAD-dependent enzymes include two types of enzymes (identity less than 30%) that are related to the introduction of the hydro-acid group into the compound. 1. The two types of protein (M.loti MAFF303099 ubiH and P.putida PpG7 nahG) were developed in vivo by using the same group of proteins. The formation rate of the same gene in vivo is low. In addition to the above, most of the above are also related to the gene sequence of the enzyme. The reason for this is unclear. It's two-way ligation. It's three-way ligation. It's DNA.しかしながら、キメラ遗伝子の割合を上升させることはできなかった。2. The enzyme activity of E. coli HMS174 was determined by the substrate of MHPC and salicylate hydroxylase. The evaluation system of enzyme is developed. Cell extracts were evaluated for the presence of 5-hydroxy-3-carboxylic acid and NADH, and for the activity of MHPC and salicylate hydroxylase. The activity of the enzyme is lower than that of the enzyme.

项目成果

Identification of a new tetrameric pyridoxal 4-dehydrogenase as the sccond enzyme in the degradation pathway for pyridoxine in a nitrogen-fixing symbiotic bacterium, Mesorhizobium loti.

鉴定出一种新的四聚体吡哆醛 4-脱氢酶，作为固氮共生细菌 Mesorhizobium Loti 中吡哆醇降解途径中的第二种酶。

• 发表时间: 2006
• 期刊: Arch Biochem Biophys 452(1)
• 作者: Yokochi N.;Nishimura S.;Yoshikane Y.;Ohnishi K.;Yagi T.
• 通讯作者: Yagi T.

Directed evolution of extradiol dioxygenase by a novel in vivo DNA shuffling.

通过新型体内 DNA 改组定向进化 Extradiol 双加氧酶。

• 发表时间: 2006
• 期刊: Gene (印刷中)
• 作者: Xu S.;Ju J.;Misono H.;Ohnishi K.
• 通讯作者: Ohnishi K.

Gene identification and characterization of the pyridoxine degradative enzyme 4-pyridoxic acid dehydrogenase from the nitrogen-fixing symbiotic bacterium Mesorhizobium loti MAFF303099

• DOI: 10.1093/jb/mvn010
• 发表时间: 2008-05-01
• 期刊: JOURNAL OF BIOCHEMISTRY
• 影响因子: 2.7
• 作者: Ge, Fei;Yokochi, Nana;Yagi, Toshiharu
• 通讯作者: Yagi, Toshiharu

進化分子工学を用いた細菌アラニンラセマーゼの高機能化

利用进化分子工程改善细菌丙氨酸消旋酶的功能

• 发表时间: 2007
• 作者: 大西 浩平;鞠 建松;味園 春雄
• 通讯作者: 味園 春雄

Crystal Structure of Pyridoxamine-Pyruvate Aminotransferase from Mesorhizobium loti MAFF303099*

• DOI: 10.1074/jbc.m708061200
• 发表时间: 2008-01
• 期刊: Journal of Biological Chemistry
• 影响因子: 4.8
• 作者: Yu Yoshikane;N. Yokochi;M. Yamasaki;K. Mizutani;K. Ohnishi;B. Mikami;H. Hayashi;T. Yagi