精子における遺伝子機能解析と新しい不妊診断・治療法への臨床応用

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既存のデータベースから得られるマウスのexpressed sequence tag(EST)をマイクロアレイ作製のためのスポット用DNAとして利用するほか、男性不妊に関与するとされる遺伝子群に特異的なプライマーセットを準備し、ゲノムDNAもしくは、mRNAから合成したcDNAを鋳型としてPCR増幅した断片をスポット用DNAとして使用した。7〜8週齢ICR系の雄マウスの精巣上体から精子を採取し不連続な濃度勾配を設けたパーコール液を通しての遠心分離、またはswim up法により運動精子のみを分離した。体細胞の混入を避けるため、0.5%Triton X-100で得られた精子を洗浄しておいた。得られた精子からTotal RNAを抽出した後、オリゴ(dT)を付加した担体を用いてポリA構造を持つmRNAを分離し、ゲノムDNAの混入を避けるため、RNase-freeのDNaseで処理しておき、これを鋳型としたRT-PCRによりcDNAを作成し蛍光色素で標識しておいた。得られたcDNAをガラスのフィルター上に貼り付けられたプローブとハイブリダイズさせ、蛍光のマイクロアレイ用スキャナーを用いて、マイクロアレイ上の蛍光量を測定する。精子mRNAをマイクロアレイで解析する本法の有用性を確かめるために、実際の精巣での遺伝子発現と精子に存在するmRNAとの比較・検討を行った。精子を採取したマウスの精巣組織から同様にmRNAを抽出し、マイクロアレイ法により遺伝子発現プロファイルを得たところ、精子mRNAの解析から得られた結果とほぼ一致した。続いて不妊モデルマウスから得られた精子を用いて同様にマイクロアレイを行い遺伝子発現プロファイルを得て、マウス精巣のcDNAライブラリとの間で発現パターンを比較したところ1000を超える遺伝子が発現の増強または減弱を示した。現在、これらの結果を解析中である。