出芽酵母におけるゲノムの再構成技術の開発と応用

酿酒酵母基因组重建技术的开发及应用

• 批准号: 19658132
• 负责人: 原島 俊
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-19658132/
• 关键词: 酵母; ゲノムの再構成; 染色体分断; ゲノム育種; 遺伝子重複機能

本研究の目的は、「染色体の分断技術」を利用して出芽酵母の染色体を細かく分断し、それらの種々の組合わせの脱落によって「ゲノムを再構成する技術」を開発することである。しかし、そのためには、ミニ染色体の分配を自在に制御する技術が必要である。本年度は、ミニ染色体の分配制御技術開発に必要な基盤的な知見を得るため以下の研究を行った。出芽酵母では、染色体のサイズが50kb以下になると細胞分裂時に娘細胞へうまく伝達されず高頻度で脱落する。これまでに多コピーでミニ染色体の伝達を安定化させる遺伝子の探索を行い、機能未知の遺伝子YCRO41Wの多コピー化が、ミニ染色体YAC-AWAの脱落率を84%低下させることを明らかにしている。本研究ではYCRO41Wのミニ染色体安定化機能について解析を行った。まず、多コピー型プラスミドpYES2のGAL1プロモーターの下流にYCRO41WのORFのみをクローン化し、YAC-AWAを持つ酵母細胞へ導入した。この形質転換体をガラクトース培地で培養して、2世代間でのYAC-AWAの脱落率を測定したところ、脱落率は35%低下した。また、YCRO41WのORFから開始コドンを除去した場合には脱落率は低下しなかった。このことから、YCRO41Wタンパク質としてミニ染色体の安定化に寄与することが示唆された。以前の研究により、ミニ染色体を持つ細胞は、細胞分裂期において2つの異常を引き起こすことが知られている。ひとつは姉妹染色分体が早期に分離する異常であり、もうひとつは紡錘体の伸張後も姉妹染色分体が共に片方の極に留まる異常である。そこで、YCRO41Wがこれらの異常を軽減させるかどうかを調べた。YCRO41Wを多コピーで導入した細胞において、紡錘極をCFP、ミニ染色体をGFPで標識し、細胞分裂期の様子を蛍光顕微鏡で観察した。その結果、姉妹染色分体が早期に分離する細胞の割合は、34%から16%まで低下した。また、紡錘体の伸張後も姉妹染色分体が共に片方の極に留まる細胞の割合は18%から0%まで低下した。このことから、YCRO41Wは細胞分裂期においてミニ染色体の二方向性の確立を正常化させる機能を持っことが示唆された。

は の purpose, this study "chromosome の breaking technology" を using し て の budding yeast chromosome を fine か く breaking し, そ れ ら の kind 々 の combination わ せ の off に よ っ て "ゲ ノ ム を reconstitution す る technology" を open 発 す る こ と で あ る. <s:1>, そ, ために, ために, ニ, chromosome <s:1> distribution を free に control する technology が necessary である. This year, the development of に and ニ chromosome <s:1> division technology for に necessary な base plates な insights を るため the following <s:1> research を fields った. Budding yeast で は, chromosome の サ イ ズ が below 50 KB に な る と cell divides に niang cells へ う ま く 伝 da さ れ ず high frequency fall off で す る. こ れ ま で に more コ ピ ー で ミ ニ chromosome の 伝 da を stabilization さ せ る heritage 伝 の exploration line を い, function unknown の posthumous son 伝 YCRO41W の more コ ピ ー が, ミ ニ chromosome YAC - AWA を の loss rate low 84% さ せ る こ と を Ming ら か に し て い る. In this study, the chromosomal stabilization mechanism of で で YCRO41W <s:1> ニ is analyzed by に で て て て to explain the を line った. Type ま ず, multiple コ ピ ー プ ラ ス ミ ド pYES2 の GAL1 プ ロ モ ー タ ー の obscene に YCRO41W の ORF の み を ク ロ ー ン し, YAC - AWA を hold つ yeast cells へ import し た. こ の form quality planning in body を ガ ラ ク ト ー ス petty で cultivate し て, between two generations で の YAC - AWA を の loss rate determination し た と こ ろ, low loss rate は 35% し た. Youdaoplaceholder0, YCRO41W <s:1> ORF ら starting from ら, <s:1> を を excluding <s:1>, the に <s:1> shedding rate <e:1> is low in た な った った った った. こ の こ と か ら, YCRO41W タ ン パ ク qualitative と し て ミ ニ chromosome の stabilization に send す る こ と が in stopping さ れ た. Previous research の に よ り, ミ を ニ chromosomes hold は つ cells, cell division period に お い て 2 つ の abnormal を lead き up こ す こ と が know ら れ て い る. ひ と つ は and sisters chromatids separation が early に す る abnormal で あ り, も う ひ と つ は spindle の も after stretching and sisters chromatid が に total of party の extremely に leave ま る abnormal で あ る. そ こ で, YCRO41W が こ れ ら の abnormal を 軽 minus さ せ る か ど う か を adjustable べ た. YCRO41W を more コ ピ ー で import し た cells に お い て, spindle を CFP, ミ ニ chromosome を GFP で logo し, cell division period の others child を 蛍 light 顕 micromirror で 観 examine し た. Youdaoplaceholder0 <s:1> results, 姉 sister stained clones が early に isolated する cells <s:1> conjoined ら, 34% ら ら16%まで low た た. ま た, spindle の も after stretching and sisters chromatid が に total of party の extremely に leave ま る cells の 18% cut in は か ら 0% ま で low し た. こ の こ と か ら, YCRO41W は cell division period に お い て ミ ニ chromosome の two directional の establish を normalization さ せ る function を hold っ こ と が in stopping さ れ た.

项目成果

PCR-mediated one-step deletion of targeted chromosomal regions in haploid Saccharomyces cerevisiae

• DOI: 10.1007/s00253-008-1609-9
• 发表时间: 2008-09-01
• 期刊: APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY
• 影响因子: 5
• 作者: Sugiyama, Minetaka;Nakazawa, Toshimasa;Harashima, Satoshi
• 通讯作者: Harashima, Satoshi

Conditional chromosome splitting in Saccharomyces cerevisiae using thehoming endonuclease PI-Scel.

使用归巢核酸内切酶 PI-Scel 在酿酒酵母中进行条件染色体分裂。

• 发表时间: 2008
• 期刊: Appl. Microbiol. Biotechnol. 79
• 作者: Yamagishi;K.;Sugiyama;M.;Kaneko;Y.;Harashima;S.
• 通讯作者: S.

Construction and characterization of single-gene chromosomes in Saccharomyces cerevisiae.

酿酒酵母单基因染色体的构建和表征。

• 发表时间: 2008
• 期刊: J. Biosci. Bioeng. 106
• 作者: Yamagishi;K.;Sugiyama;M.;Kaneko;Y.;Nishizawa;M.;Harashima;S.
• 通讯作者: S.