出芽酵母の全プロテインホスファターゼ遺伝子二重破壊変異株の作製と機能解析

酿酒酵母全蛋白磷酸酶基因双破坏突变体的构建及功能分析

• 批准号: 12024213
• 负责人: 原島 俊
• 金额: $ 1.66万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 2000
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2000 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-12024213/
• 关键词: 酵母; プロテインホスファターゼ; ゲノム

タンパク質のリン酸化・脱リン酸化は、細胞機能の代表的な制御様式である。ゲノムの全塩基配列から、出芽酵母には、117種のプロテインキナーゼ(PKase)、32種のプロテインホスファターゼ(PPase)が存在すると推定されている。一方、出芽酵母では約250種のリン酸化タンパクが報告されているが、それらがどのようなPKaseによってリン酸化され、どのようなPPaseによって脱リン酸化されるかについては、断片的な知見が得られているに過ぎない。本研究では、「真核生物におけるタンパク質のリン酸化・脱リン酸化による細胞機能制御の全体像」を明らかにすることを目指して、出芽酵母の32種のPPaseについて、単独破壊株だけでなく、全ての組合わせの二重破壊株を作成し、その網羅的な表現型解析から、それぞれのPPaseが、どのような細胞生理に関わっているかを明らかにすることを目的とした。まず、W303-1A(a接合型)株から形質転換法で単一破壊株を作成した。その結果、32個のうち2個(CDC14、GLC7)が必須遺伝子であり、残りの30種のPPase遺伝子破壊株は生育可能であることが分かった。遺伝子破壊が致死でない30種のPPaseについて、接合型の異なる破壊株をそれぞれ作成し、全ての組合わせ(435通り)で交雑とランダム胞子分離法法により二重破壊株を作成した。その結果、430組みの二重破壊株が生存可能であり、5組みの二重破壊株(Δsit4Δptc1、Δsit4Δptc3、Δsit4Δptc4、Δsit4Δppg1、Δsit4Δynr022c)が致死であることがわかった。また、二重破壊株が生育可能であった430株について、網羅的な表現型の解析を目指した。その結果、現在までに調べた温度感受性、炭素源資化性、塩感受性、薬剤感受性表現型について、約100株がなんらかの表現型を示した。そこで、それらの全てについて、野生型株と雑種二倍体を作成し、四分子分析を行なったところ、Δpph21Δpph22およびΔppz1Δppz2二重破壊株が示す37oCでの増殖遅延表現型、またΔptc2Δmsg5二重破壊株が示すNaCl、CaCl2感受性表現型、Δptp2Δmsg5二重破壊株が示すCaCl2感受性の表現型が実際に二重破壊によって引き起こされていることがわかった。本研究によって世界で初めて構築されたPPase二重破壊株のシリーズを利用して、今後は、さらに多くの表現型を網羅的に解析し、それぞれのPPaseがどのような細胞生理に関与するかを明らかにしたい。また、PPase破壊株における約250あるリン酸化タンパク質のリン酸化レベルの解析(ホスホプロテオーム解析)も行う予定である。

The regulation of cell function is the key to the development of cell function. The total base alignment of the species, budding yeast, 117 species of PKase and 32 species of PPase are presumed to exist. About 250 species of budding yeasts were identified and reported. PKase was identified and purified. PPase was identified and purified. In this study, we focused on the phenotypic analysis of PPases from 32 species of budding yeasts, isolated strains, complete combinations, double breaks, and ensembles in eukaryotes. The purpose of this study is to investigate the relationship between the two genes. W303-1A(a-conjugating type) strain was produced by the method of morphological transformation. The results were 32 (CDC14, GLC7) and 30 (PPase 7). 30 kinds of PPase were isolated from each other, and all kinds of PPase were isolated from each other. The results showed that 430 groups of double broken plants could survive, 5 groups of double broken plants (Δsit4Δptc1, Δsit4Δptc3, Δ sit 4 Δ ptc 4, Δsit4Δppg1, Δsit4Δynr022c) could die. There are 430 plants with high fertility potential and a comprehensive analysis of their phenotypes. As a result, about 100 phenotypes of plants with temperature sensitivity, carbon source sensitivity, carbon sensitivity and carbon sensitivity were shown. The diploids of wild type and wild type strains were prepared, tetramolecular analysis was performed, Δpph21Δpph22 and Δppz1Δppz2 double disruption strains showed the propagation delay phenotype at 37 ℃, Δptc2Δmsg5 double disruption strains showed the NaCl and CaCl2-sensitive phenotype, Δ ptp2Δ msg 5 double disruption strains showed the CaCl2-sensitive phenotype. This research is aimed at utilizing the research materials of PPase double mutants that have been constructed for the first time in the world, and will be used to analyze many phenotypes in the future. It is clear that PPase is related to cell physiology. The PPase gene was detected at about 250 ℃.