バイオインテリジェント化幹細胞を用いた歯周組織移植療法の開発

利用生物智能干细胞开发牙周组织移植疗法

基本信息

批准号：
19659548
负责人：
山田聡
金额：
$ 2.05万
依托单位：
Osaka University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

(1)歯根膜細胞への外来遺伝子導入条件の検討GFP発現プラスミドベクターをリポフェクション法、エレクトロポレーション法、センダイウイルス法を用いて細胞に遺伝子導入し、各方法における導入効率を比較検討した。ホスト細胞として、マウス歯根膜細胞株MPDL22、ヒト腎由来293細胞、マウス胚性細胞株ECP19を用いた。GFP発現ベクターの導入効率をレーザー蛍光顕微鏡にて観察したところ、293細胞およびECP19細胞には何れの導入方法でもGFP遺伝子を導入することが可能であったが、MPDL22には唯一エレクトロポレーション法のみが有効であった。(2)歯根膜遺伝子導入による細胞のバイオインテリジェント化誘導歯根膜遺伝子として、PLAP-1、Periostin、SFRP4、ID1を選定し、各遺伝子発現ベクターを構築した。上記(1)にて決定した条件でMPDL22に遺伝子導入した。各遺伝子導入細胞を硬組織形成誘導培地にて長期に培養し、石灰化マーカーであるアルカリフォスファターゼ活性および石灰化物形成能を測定した。その結果、PLAP-1、SFRP4導入により歯根膜細胞の硬組織形成分化が抑制を受けた。そのメカニズムは、PLAP-1はBMP-2/4、TGF-β等のTGFスパーファミリー分子の機能阻害、SFRP4はWnt分子の機能阻害である可能性が強く示唆された。一方、Periostin遺伝子導入により、歯根膜細胞の石灰化が促進された。ID1導入では歯根膜細胞の分化には影響を認めなかった。以上の結果からPLAP-1、SFRP4、Periostinは歯根膜細胞のバイオインテリジェント化に利用可能な遺伝子であることが示唆された。

（1）检查外国基因转移到牙周韧带细胞的条件。基因使用Lipofection方法，电穿孔方法和仙台病毒方法转移到细胞中，并比较并检查了每种方法的转移效率。小鼠牙周韧带细胞系MPDL22，衍生自人肾的293个细胞，将小鼠胚胎细胞系ECP19用作宿主细胞。当使用激光荧光显微镜观察GFP表达载体的转移效率时，可以使用任何一种引入方法将GFP基因转移到293个细胞和ECP19细胞中，但仅电穿孔对MPDL22有效。（2）通过牙周韧带基因转移选择PLAP-1，骨化蛋白，SFRP4和ID1作为生物智能诱导细胞，并构建了每个基因表达载体。在上述（1）中确定的条件下，将基因转移到MPDL22中。将每个转基因细胞长时间培养在硬组织形成诱导培养基中，并在碱性磷酸酶（钙化标记）的活性中培养，并测量形成钙化的能力。结果，PLAP-1和SFRP4引入了抑制牙周韧带细胞的硬组织分化。强烈建议，PLAP-1的机制可以抑制TGF SPAR家族分子（例如BMP-2/4和TGF-β）的功能，而SFRP4的功能可以抑制Wnt分子的功能。另一方面，骨膜蛋白基因的引入促进了牙周韧带细胞的钙化。 ID1的引入不会影响牙周韧带细胞分化。以上结果表明，PLAP-1，SFRP4和骨膜素是可用于牙周韧带细胞生物智能化的基因。