変異型γδ型TCRのX線結晶解析構造と抗原認識能との相関解析

突变型γδTCR的X射线晶体分析结构与抗原识别能力的相关性分析

基本信息

批准号：
14770139
负责人：
田中義正
金额：
$ 2.43万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

ヒトγδ型T細胞は、結核菌、マラリア原虫、大腸菌O157など病原性微生物の産生するピロリン酸モノエステル系化合物、プロテウスなど病原性細菌の産生するアルキルアミン系化合物、高カルシウム血症などの治療薬として知られる窒素含有型ビスホスホン酸系化合物などを認識して、様々なエフェクター作用を呈する。一般に、αβ型T細胞はMHCに拘束されたペプチド性抗原をαβ型T細胞受容体で認識するが、γδ型T細胞はMHC非依存的に非ペプチド性抗原を認識するため、その詳細な認識機構はほとんど明らかにされていない。今回、γδ型T細胞受容体にアラニン置換の点変異を行い、T細胞受容体陰性のJurkat細胞をトランスフォームし、変異γδ型T細胞受容体を発現する種々のJurkat細胞を樹立し、その反応性を詳細に解析した。また、それら変異型γδ型T細胞受容体を大腸菌で発現させ、結晶化を行うことにより、X線結晶構造解析のための準備を行った。変異実験に関しては、γK109、δR51、δL97をアラニン置換することにより、全ての非ペプチド性抗原に対する認識能が消失した。このことより、機能的にはこの3つのアミノ酸残基が非ペプチド性抗原認識に重要な役割を果たしていることが明らかになった。また、γδ型T細胞受容体の結晶解析に関しては、γ鎖およびδ鎖を大腸菌で発現させ、それぞれの封入体を精製し、アルギニンベースの緩衝液でリフォールドした。さらに、PEGベースの緩衝液中で結晶化を行い、X線結晶解析のための準備を整えた。今後、機能と構造の相関関係を明らかにすることにより、γδ型T細胞による非ペプチド性抗原認識能を明らかにする予定である。

人γδ型T细胞识别由致病性微生物产生的焦磷酸单酯化合物，例如结核分枝杆菌，疟原虫寄生虫，大肠杆菌O157，烷基胺化合物，烷基化合物，由致病性细菌等致病性细菌产生高钙血症和其他此类作用。通常，αβ型T细胞在αβ型T细胞受体处识别MHC受限的肽抗原，而γδ型T细胞以非肽含量不依赖于MHC的方式识别非肽抗原，因此已经揭示了其详细的识别机制。在本文中，在γδ型细胞受体上进行了丙氨酸取代的点突变，用负T细胞受体转化Jurkat细胞，并建立了表达突变的γδT型T细胞受体的各种Jurkat细胞，并详细分析了它们的反应性。此外，这些突变的γδ型T细胞受体在大肠杆菌中表达，并结晶以准备X射线晶体结构分析。关于突变实验，丙氨酸取代γK109，ΔR51和ΔL97导致所有非肽抗原的识别能力丧失。这表明这三个氨基酸残基在识别非肽抗原方面起着重要作用。此外，为了对γδ型T细胞受体进行晶体学分析，在大肠杆菌中表达γ和δ型链链，并用基于精氨酸的缓冲液纯化每个包含体并重折叠。此外，在基于PEG的缓冲液中进行结晶以准备X射线晶体学。将来，我们计划通过阐明功能与结构之间的相关性来阐明γδ型T细胞识别非肽抗原的能力。