ジグリセリドキナーゼに関する生化学的,遺伝子工学的検討

甘油二酯激酶的生化和基因工程研究

• 批准号: 04454158
• 负责人: 加納 英雄
• 金额: $ 4.48万
• 依托单位: Sapporo Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (B)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 1993
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04454158/
• 关键词: ジアシルグリセロールキナーゼ; ホスファチジン酸; ホスファチジン酸ホスファターゼ; ジアシルグソセロールキナーゼ; シグナル伝達; 遺伝子工学; EFハンド; 亜鉛フィンガー

ジアシルグリセロール(DG)をホスファチジン酸に変換するDGキナーゼ(DGK)について、分子生物学的検討を行なった。PAホスファターゼについても酵素精製に成功後(JBC,-92)、cDNAクローニング中である。1。最初にクローン化されたDGKアイソザイム(alpha型)の、ラット脳におけるオリゴデンドログリアに限局した発現が明らかにされた(Mol.Brain Res.-92)。2.DGKalphaへ転写調節機構を解明するため、ヒト染色体遺伝子をクローン化して解析した。この遺伝子はハウスキーピング遺伝子の特徴を持ち、5′-フランキング部位は基本的なプロモーター活性を示すが、この遺伝子の細胞特異的な発現機序を説明できなかった(BJ.-93)。3.第3番目のヒトDGKアイソザイム(gamma型)のcDNAクローニングを行なった(投稿中)。DGKgammaはヒト網膜に特徴的に強く発現しているが、ほかの組織、細胞での発現は極めて少ない。更に脳と網膜以外の細胞では、25アミノ酸残基欠損した不活性の酵素をコードする、短縮型mRNAが発現していた。亜鉛フィンガー、EFハンドなどの基本構造は保持されている。4.DGKの亜鉛フィンガーの機能を調べるために、この部位の点変異導入型、欠損型のcDNAを調製し、COS細胞、Sf9細胞で発現させて、変異型酵素の性質を調べた。いずれの変異体にも弱いながらDGK活性が残存した。一方変異体のホスファチジルセリン結合能が著しく低下していた。DGKの亜鉛フィンガーはDG結合部位ではなく、リン脂質結合部位であることが示唆された。5.DGKの機能を明らかにする目的で、ブタDGKaを安定発現するNIH3T3細胞クローンを得て、解析中である。前報(FEBS Lett.,-92)に一致して、これらのクローンの細胞内DG量は半減したが、細胞増殖能が著しく亢進していた。細胞内で生成したPAやリゾPAの機能はこれまで検討されていない。DGK発現による細胞増殖の機序を検討中である。

ジ ア シ ル グ リ セ ロ ー ル (DG) を ホ ス フ ァ チ ジ ン acid に variations in す る DG キ ナ ー ゼ (DGK) に つ い て line, molecular biology of beg を 検 な っ た. PAホスファタ ホスファタ ゼに ゼに グ て て て after the successful refinement of に (JBC,-92), cDNA <s:1> ロ ニ ニ グ グ グ グ グ グ である. 1. Initial に ク ロ ー ン change さ れ た DGK ア イ ソ ザ イ ム (alpha) の, ラ ッ ト 脳 に お け る オ リ ゴ デ ン ド ロ グ リ ア に limit bureau し た 発 now が Ming ら か に さ れ た (Mol. Brain Res., 92). 2. DGKalpha へ planning write regulator を interpret す る た め, ヒ ト chromosome heritage 伝 son を ク ロ ー ン change し て parsing し た. こ の posthumous son 伝 は ハ ウ ス キ ー ピ ン グ heritage 伝 ithream by の 徴 を hold ち, 5 '- フ ラ ン キ ン グ parts は basic な プ ロ モ ー タ を ー activity in す が, こ の heritage 伝 の cells specific な 発 now machine sequence を illustrate で き な か っ た (BJ. J - 93). 3. Third order: <s:1> ヒトDGKア ソザ ソザ ム(gamma type) <s:1> cDNA ロ ロ ニ ニ グを グを なった line なった(submission in progress). DGKgamma は ヒ ト retinal に 徴 of strong に く 発 now し て い る が, ほ か の tissue, cell で の 発 は now extremely め て less な い. More に 脳 と outside の retinal cells で は, 25 ア ミ ノ acid residues owe loss し た not active の enzyme を コ ー ド す る, shortening mRNA が 発 now し て い た. The basic structure of 亜 lead フィ フィ ガ ガ ガ ガ and EFハ <e:1> ドな <s:1> is maintained at されて る る. 4. DGK の 亜 lead フ ィ ン ガ ー の function を adjustable べ る た め に, こ の parts の points - different import, owe loss の cDNA を し, cosine modulation cells, Sf9 cells で 発 now さ せ て, の - different enzyme properties を べ た. Youdaoplaceholder0 ずれ <s:1> variant に ながら weak ながら ながらDGK active が residual た た. One variant has a ホスファチジ, セリ, <s:1> binding energy が, <s:1> く, low <s:1>, て, た, た. DGK の 亜 lead フ ィ ン ガ ー は DG combining site で は な く, リ ン lipid binding site で あ る こ と が in stopping さ れ た. 5. DGK の function を Ming ら か に す る purpose で, ブ タ DGKa を settle 発 now す る NIH3T3 cells ク ロ ー ン を て, parsing で あ る. Before quote (FEBS Lett., 92) に consistent し て, こ れ ら の ク ロ ー ン DG の cell quantity は half し た が, cells raised colonization が し く hyperthyroidism し て い た. The で within cells generates the <s:1> たPAやリゾPA <s:1> function of the <s:1> れまで検 れまで検 to seek the されて な な な. DGK reveals による cell proliferation sequence を検 discusses である.

项目成果

Mizunuma,Masahiro: "Phospholipase D activity of human amnion cells stimu-lated with phorbol ester and badykinin" Biochim.Biophys.Acta. 1168. 213-219 (1993)

Mizunuma,Masahiro：“用佛波酯和巴迪激肽刺激人羊膜细胞的磷脂酶 D 活性”Biochim.Biophys.Acta。

Fujikawa,Koshi: "Isolation and characterization of the human diacyl-glycerol kinase gene" Biochem.J.294. 443-449 (1993)

Fujikawa，Koshi：“人二酰基甘油激酶基因的分离和表征”Biochem.J.294。

加納 英雄: "DGキナーゼ Neurs sceince講座V.セカンドメッセンジャー産生酵素" 広川書店,

嘉纳英夫：《DG激酶神经科学课程V.第二信使生产酶》广川书店，

Fu,Tao: "Abolishment of bradykinin-induced calcium oscillations in ras-transformed fibroblasts by the expression of 80 kDa diacylglycerol kinase" FEBS Lett.307. 301-304 (1992)

Fu，Tao：“通过表达 80 kDa 二酰甘油激酶消除 ras 转化的成纤维细胞中缓激肽诱导的钙振荡”FEBS Lett.307。

坂根郁夫: "ジアシルグリセロールキナーゼ" Clinical Calcium. 3. 50-56 (1993)

Ikuo Sakane：“二酰甘油激酶”临床钙。3. 50-56 (1993)