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PCR法を用いたDNA塩基配列レベルでのウェステルマン肺吸虫2倍体と3倍体の異同

使用PCR方法在DNA序列水平上观察二倍体和三倍体韦氏肺吸虫的差异

基本信息

批准号：
05670228
负责人：
吾妻健
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kochi Medical School
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05670228/
关键词：
ミトコンドリアDNA PCR RFLP ウェステルマン肺吸虫 3倍体

项目摘要

ウエステルマン肺吸虫の材料は、2倍体は大分、兵庫、三重、千葉の4地域から、3倍体は対馬、天草、屋久島の3地域からそれぞれメタセルカリアの感染したサワガニやモクズガニを採集し、犬及び猫に感染させ150日前後に成熟成虫を回収した。まず制限酵素切断パターンの解析を行なった。回収した成虫は一匹ごとにリン酸緩衝液にてホモジナイズしTamura & Aotsuka(1988)の方法にしたがってミトコンドリアDNAを分離した。分離されたミトコンドリアDNAは、エチジウムブロマイド染色(アガロースゲル電気泳動)や銀染色(アクリルアミドゲル電気泳動)で識別するのに十分に精製されていた。今回用いた制限酵素は6塩基対cutterではAccI,ApaI,BgIII,EcoRV,HincII,PstI,pvuII,SacI,SmaI,SphI,XbaIの11種類、4塩基対ではHaeIII,HinfI,MspI.RsaIの4種類である。サザーンブロッティングハイブリダイゼーションではdigoxigeninでラベルされたUTPの取り込みを利用した方法を用いてプローブを作成した。その結果、多型現象は6base cutterではほとんど認められなかったが4base cutterでは集団内外に観察された。しかしその程度はかなり低いものであった。3つの制限酵素(PstI,HaeIII,RsaI)の切断パターンにおいて、2倍体と3倍体が異なることを見い出した。特にPstIでは、どの2倍体も唯一のcutting site(一本のバンド)を有するのに対して3倍体はどの個体も常に2箇所のcutting site(2本のバンド)を持つことが分かった。4base cutter のHaeIIIとRsaIでは、多数のバンドが得られたが、その中の一部のバンドが倍数性に特有なパターンを示し、両者を分けることができた。一方ミトコンドリアDNAのチトクロームcオキシダーゼサブユニットI(COI)の一部の領域をPCR法を用いて増幅しpGEMベクターにクローニングした。これをABIのシーケンサー373A型により塩基配列を決定し比較したところ、この領域では違いは認められなかった。以上の結果より、日本産ウエステルマン肺吸虫の3倍体は日本産の2倍体とはミトコンドリアDNAの制限酵素切断パターンのレベルでも異なっていることが分かり我々の雑種起源説を支持する結論に達した。

Paragonimus material was collected from 4 regions of Oita, Hyogo, Mie and Chiba, and from 3 regions of Equus, Amakusa and Yakushima, and mature adults were collected from 150 days of infection in dogs and cats. The analysis of the restriction enzyme sequence is performed. The method of Tamura & Aotsuka(1988) was used to isolate DNA. The separation of DNA from the sample was carried out in a very refined manner by means of electrophoresis and silver staining. The restriction enzymes used in this study are 6-base cutter for AccI,ApaI,BgIII,EcoRV,HincII,PstI,pvuII,SacI,SmaI,SphI,XbaI, 4-base cutter for HaeIII,HinfI,MspI. The first step is to use the digoxigenin as a catalyst for the development of the new technology. As a result, polytype phenomenon is 6base cutter 4base cutterしかしその程度はかなり低いものであった。3. Restriction enzymes (PstI,HaeIII,RsaI) are present in the cleavage of diploids and triploids. In particular, PstI, PstI, PstI 4base cutter HaeIII and RsaI, most of which are unique to each other, and some of which are unique to each other A part of the domain PCR method for the detection of DNA was used to amplify pGEM DNA. The ABI and the 373A are the most important parts of the system. The above results support the hypothesis of the origin of paragonimus species.