神経系特異タンパク遺伝子の細胞特異的に働く転写調節領域の解析

点击翻译按钮获取中文摘要

マウス2′,3′-環状ヌクレオチド3′-フォスフォジエステラーゼ(CNP)遺伝子では転写開始点が約900bp離れた位置に2ケ所存在する。上流の転写開始点から転写されるRNAIIは5′上流にエキソンを1つ余分に持ち、その3′-スプライシング部位は下流の転写開始点から転写されるRNAIの5′非翻訳領域内にある。本年度は上流の転写開始点より下流に存在する領域のRNAIに対する転写調節活性を調べる目的でこの領域をクロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)の上流に接続した後ExonucleaseIII-Mung Bean nuclease系を用いて種々の長さの5′欠失プロモーターを持つCATプラスミドを構築した。これらのプラスミドを用いてラットグリオーマ細胞であるC6細胞にトランスフェクション実験を行なってプロモーターの長さによる転写活性の変化を調べた。下流の転写開始点を+1とした時-345bpより上流の領域を含む場合は転写が抑制され、この領域を除くと転写活性が非常に強くなった。また、-345bpよりさらに短くなったプロモーターでは再び転写活性が低下した。このことから下流の転写開始点から-345bp付近に転写を強く活性化するシス因子の存在が示唆されたため、DNAseIフットプリント法を用いて解析を行なった。その結果、トランスフェクション実験において欠失させると転写活性が低下する領域に強く保護される部分が見いだされた。CNPを発現していない細胞においてのプロモーター活性の解析は同じ一連のCATプラスミドを用いてBalb/C3T3細胞に対して現在行なっている。