分子間力測定、高速イメージング、認識イメージングによる転写調節機構の解明

転写調節における分子メカニズムの解明のため、RNAポリメラーゼのサブユニットや転写調節タンパク質の、遺伝子プロモーター上での会合様式をナノスケール可視化解析により明らかにする。そのために、実験材料としては、比較的転写装置が単純で解析が容易な大腸菌の系を用い、原子間力顕微鏡(AFM)によるナノスケール観察を行なう。とりわけ、RNAポリメラーゼのサブユニットの一つであるσファクターと、大腸菌の代表的な転写抑制因子H-NSに焦点を当てた解析を行なうこと、また、H-NSによる転写抑制を阻害するLerについても、その分子メカニズムを解明することを目的とした。申請者らは、H-NSがRNAポリメラーゼのαサブユニットと結合することを見出した。そこで、プロモーター近傍に結合したH-NSがRNAポリメラーゼと相互作用することによりその伸長を阻害するというモデルの提唱した。これまでに、(1)通常の大気中AFM観察により、LEE5プロモーターとH-NSとの相互作用様式を明らかにした。(2)競合的にDNAに結合すると考えられるLerとH-NSとについて、共存在下でのDNA結合様式について生化学的解析とAFMによる可視化解析とによって明らかにした。申請時には計画していなかったことであるが、RNAを大腸菌を超音波処理のみにより破砕しショ糖密度勾配法により分画した特定の画分には、細胞膜断片にタンパク質を介してゲノムDNAが結合していることが分かった。LC/MS/MS等の解析からこの介在タンパク質はMreBであることが確実となった。またMreBで免疫沈降をすると、RNA-ポリメラーゼ、転写伸張因子、リボソームタンパク質、FoF1-ATPase等が共沈することも分かった。すなわち、アクチン様タンパク質であるMreBがRNAポリメラーゼや伸張因子を介して核様体を細胞膜に繋ぎ留める役目を果たしていると考える。「細胞膜・細胞骨格・ゲノムDNA・DNAポリメラーゼが織りなす転写制御モデル」を提唱した。

転写調節における分子メカニズムの解明のため、RNAポリメラーゼのサブユニットや転写調節タンパク質の、遺伝子プロモーター上での会合様式をナノスケール可視化解析により明らかにする。そのために、実験材料としては、比較的転写装置が単純で解析が容易な大腸菌の系を用い、原子間力顕微鏡(AFM)によるナノスケール観察を行なう。とりわけ、RNAポリメラーゼのサブユニットの一つであるσファクターと、大腸菌の代表的な転写抑制因子H-NSに焦点を当てた解析を行なうこと、また、H-NSによる転写抑制を阻害するLerについても、その分子メカニズムを解明することを目的とした。申請者らは、H-NSがRNAポリメラーゼのαサブユニットと結合することを見出した。そこで、プロモーター近傍に結合したH-NSがRNAポリメラーゼと相互作用することによりその伸長を阻害するというモデルの提唱した。これまでに、(1)通常の大気中AFM観察により、LEE5プロモーターとH-NSとの相互作用様式を明らかにした。(2)競合的にDNAに結合すると考えられるLerとH-NSとについて、共存在下でのDNA結合様式について生化学的解析とAFMによる可視化解析とによって明らかにした。申請時には計画していなかったことであるが、RNAを大腸菌を超音波処理のみにより破砕しショ糖密度勾配法により分画した特定の画分には、細胞膜断片にタンパク質を介してゲノムDNAが結合していることが分かった。LC/MS/MS等の解析からこの介在タンパク質はMreBであることが確実となった。またMreBで免疫沈降をすると、RNA-ポリメラーゼ、転写伸張因子、リボソームタンパク質、FoF1-ATPase等が共沈することも分かった。すなわち、アクチン様タンパク質であるMreBがRNAポリメラーゼや伸張因子を介して核様体を細胞膜に繋ぎ留める役目を果たしていると考える。「細胞膜・細胞骨格・ゲノムDNA・DNAポリメラーゼが織りなす転写制御モデル」を提唱した。