腎臓KチャンネルcDNAのクローニング

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腎集合管より単離された、pH感受性のK channel(RACTK1)を用いホモロジークローニングを試みた。40種類のPCR増幅産物よりホモロジーの高い物から、低い物10種類についてラット腎cDNAライブラリーをスクリーニングし、3つのcDNAが単離された。しかし、1つはchannelとは無関係でtransposonの1つであった。1つは、Shaker K channelの一部にホモロジーを有する678塩基95アミノ酸をコードする2回膜貫通構造を有する蛋白であるが、K channel特有のアミノ酸配列は有していない。現在この蛋白について、発現などを検討中である。今1つのcDNAはRACTK1と90%以上のホモロジーを有し、exonskippingを有した940塩基であった。サザンブロットの結果は、RACTK1と同一のRFLPでisoformと考える。ゲノム上でのsplicingを検討するためにPCRを行ったが、exon内のskippingの可能性もあり、またtissue specificなisoformの可能性もあり、この点を明らかにするために現在ゲノムのクローニングと発現を進めている。また同じisoformは人よりも得られている。さらに新しいファミリーの検索としてPCR増幅の位置を膜貫通部位に変更し検討しているが、この場合は増幅産物の期待値が大きくmismatchの増幅産物になる可能性がある。腎外臓器についても検討し、免疫染色ではRACTK1が存在しない臓器からもホモロジーの高いプローベが得られた。結論;3つのcDNAが単離された。Alternative splicing typeのRACTK1が得られた。さらに腎外臓器では、期待できるプローベが得られcDNAを単離中である。ホモロジーの低い産物についても検討できた。