プルラン分解性を有するα‐アミラーゼの基質認識機構に関する蛋白質工学的研究

α-淀粉酶降解普鲁兰多糖底物识别机制的蛋白质工程研究

• 批准号: 07660099
• 负责人: 酒井 坦
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07660099/
• 关键词: 基質特異性の改変; タンパク質工学; 部位指定変異; サブサイト

好熱性方線菌Thermoactinomyces vulgaris R-47の生産する2種類のα‐アミラーゼTVAI,TVAIIは共に澱粉やプルランの高分子基質を分解するが、TVAIは澱粉やプルランなどの高分子基質を好み、TVAIIはオリゴ糖など低分子基質を好むなど基質特異性が異なっている。ネオプルラナーゼと共にこれらのプルラン分解性アミラーゼは一つのファミリーをなしている。TVAI,TVAIIの基質特異性の決定機構を探るため、これら3種のプルラン分解アミラーゼの1次構造を詳細に比較することにより相同領域以外の基質特異性にかかわるアミノ酸残基の候補として、特にタカアミラーゼなどのプルランを分解しないアミラーゼと比較して相同性が低くかつサブサイト近傍のループ上に位置する領域を2カ所見いだすことができた。一つはTVAIIの287-292の部分でタカアミラーゼのD168の近傍に相当する。TVAIIのこの8残基をTVAIの配列に変えた変異酵素AB76は非活性が1/100以下に低下したが、プルランに対するKm値は変化しなかった。マルトトリオースなどの低分子基質に対するKm値はTVAIに近くなり、この部分が低分子基質に対する特異性を決定していると考えられる。もう一つはTVAIIの194-207の部分でタカアミラーゼのY75,W83の部分に相当する。この部分はプルラン分解性アミラーゼではよく保存されているためプルランの認識に関していると推測した。種々の変異酵素を調製した内、TVAIIのH202Nは比活性は1/100以下に低下したが、低分子基質に対するKm値はほとんど変化しなかったのにプルランに対するKm値は非常に大きくなった。予想通りこの部分がプルランの認識に関係していることが明らかになった。しかし、いずれの変異酵素も大きく活性が低下しており今後その原因を明らかにする必要がある。

Thermoactinomyces vulgaris R - 47 の production す る 2 kinds の alpha ‐ ア ミ ラ ー ゼ TVAI, TVAII は に total starch や プ ル ラ ン を の polymer matrix decomposition す る が, TVAI は starch や プ ル ラ ン な ど の polymer matrix を good み, TVAII は オ リ ゴ sugar な ど low molecular matrix を good む な ど substrate specificity が different な っ て い る. ネ オ プ ル ラ ナ ー ゼ と altogether に こ れ ら の プ ル ラ ン decomposability ア ミ ラ ー ゼ は a つ の フ ァ ミ リ ー を な し て い る. TVAI, TVAII の substrate specificity の decision institutions を agent る た め, こ れ ら three の プ ル ラ ン decomposition ア ミ ラ ー ゼ の one construct を に comparative す る こ と に よ り areas outside the same の substrate specificity に か か わ る ア ミ ノ acid residues の alternate と し て, に タ カ ア ミ ラ ー ゼ な ど の プ ル ラ ン を decomposition し な い ア ミ ラ ー ゼ と Low comparative し て in same-sex が く か つ サ ブ サ イ ト nearly alongside の ル ー プ に position す を 2 カ る field can see い だ す こ と が で き た. A part of the <s:1> ラ TVAII <s:1> 287-292 でタカア でタカア ラ ゼ ゼ ゼ ゼ ゼ する D168 is adjacent to に and is equivalent to する. TVAII の こ の 8 residues を TVAI の match column に - え た - isoenzymes AB76 は inactive が 1/100 under low に し た が, プ ル ラ ン に す seaborne る Km numerical は variations change し な か っ た. マ ル ト ト リ オ ー ス な ど の low molecular matrix に す seaborne る Km numerical は TVAI に nearly く な り, こ の part が low molecular matrix に す seaborne る specificity を decided し て い る と exam え ら れ る. Youdaoplaceholder0 う - でタカア でタカア TVAII <s:1> 194-207 でタカア ラ ラ ゼ ゼ ゼ <s:1> Y75,W83 に is equivalent to する. こ の part は プ ル ラ ン decomposability ア ミ ラ ー ゼ で は よ く save さ れ て い る た め プ ル ラ ン の know に masato し て い る と speculation し た. Kind of 々 の - isoenzymes を modulation し た, TVAII の H202N は than low activity below 1/100 は に し た が, low molecular matrix に す seaborne る Km numerical は ほ と ん ど variations change し な か っ た の に プ ル ラ ン に す seaborne る Km numerical は very big に き く な っ た. To understand the part of the がプ がプ ラ ラ ラ になった that is related to に て る that is る that is とが that is とが that is とが that is になった that is になった that is る that is とが that is になった that is になった that is になった that is になった that is になった. し か し, い ず れ の - isoenzymes も big き く active low が し て お り future そ の reason を Ming ら か に す る necessary が あ る.

项目成果

Takashi Tonozuka: "Comparison of Transglycosylation Catalized by Two α-Amylases from Thermoactinomyces vulgaris R-47" Oyo Toshitsu Kagaku. 43(in press.). (1995)

Takashi Tonozuka：“来自普通嗜热放线菌 R-47 的两种 α-淀粉酶催化的转糖基化的比较”Oyo Toshitsu Kagaku 43（出版中）。

Takashi Tonozuka: "Comparison of primary structures and substrates specificities of two pullulan-hydrolyzing α-amylases,TVA-IandTV-II,from Themoactinomyces vulgaris R-47," Biochim.Biophys.Acta. 1252. 35-42 (1995)

Takashi Tonozuka：“来自 Themoactinomyces vulgaris R-47 的两种支链淀粉水解 α-淀粉酶 TVA-I 和 TV-II 的主要结构和底物特异性的比较”，Biochim.Biophys.Acta。