自食作用系タンパク質分解の調節に関わるリン酸化タンパク質の検索

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生理的調節を受ける自食作用系タンパク質分解の機構解明に向けて、申請者らはこの過程に関わる細胞内タンパク質性調節因子の発見を目指している。本研究では肝細胞における自食作用の促進因子として最も良く知られているグルカゴンを用い、この刺激によってリン酸化されるタンパク質が自食作用の開始点近くに存在するという仮説をたて、自食胞を含むリソソーム画分と小胞体膜画分に注目してグルカゴンによりリン酸化が誘導されるリンタンパク質を検索することを目的とした。まず、予備実験として単離肝細胞を^<32>Piで細胞内ATPをラベルし、グルカゴン処理でリン酸化されるタンパク質をリソソーム画分に検索した。リソソーム画分タンパク質をSDS-PAGEにかけ、オートラジオグラフィで検出したところ、確かに50kDa付近にグルカゴンによリン酸化されるタンパク質(pp49)が認められた。さらに研究実施計画で述べたとおり、リソソーム画分のin vitroのリン酸化反応を試みた。[γ-^<32>P]ATPとcAMP-dependent protein kinaseの触媒サブニットとの反応により多数のタンパク質がリン酸化されたが特に50kDa付近には4〜5本のバンドが見られた。研究の実施中出てきた問題点として次の2点がある。1)リソソーム画分をPercoll密度勾配法で得ているが、その純度と再現性の問題。2)タンパク質精製へ進むために収量確保のためにin vitroのリン酸化反応を試みているが、いわゆるin vivoのリン酸化と比較するとリン酸化のパターンが異なっていた。両者で同一のバンドを正確に決定する問題。現在、この両者について更に検討を重ねると共に、次の手段としてHPLCによる精製操作を検討している。SDS-PAGEから溶出したin vitroリン酸化タンパク質(pp49)を逆相カラム(Bakerbond C8,wide pore)を用いて分離し、ほぼ単一のリンタンパク質のピークが認められている。