オートファジー(自食作用)誘導活性の測定法の開発に関する研究

自噬（autophagy）诱导活性测定方法的开发研究

• 批准号: 14657006
• 负责人: 内山 安男
• 金额: $ 1.86万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657006/
• 关键词: オートファジー; リソソーム; バルクタンパク質分解; LC3; 細胞質型LC3-I; 膜結合型LC3-II; Apg4; リン脂質

本研究では、様々な細胞や組織におけるバルクタンパク質分解活性を測定する目的で、オートファジー現象に必須なタンパク質であるLC3(microtubnle associate protein 1 light chain3)に注目し、その測定手段の開発を行った。このため、シグナルペプチドとヒスチジン-タグあるいはSタグ(Sペプチドは膵臓リボヌクレアーゼ由来のS-Proteinと高い親和性で結合する)をN末端に、GFPをC末端に付加したヒトLC3(Hisタグ-LC3-GFPあるいはS-タグ-LC3-GFP)キメラタンパク質をコードするDNAを作製した。これをバキュロウイルス-昆虫細胞(fs-9)に発現し、培養上清からニッケルあるいはS-proteinカラムを用いて同タンパク質を精製した。細胞に発現されたLC3は、C末端の5アミノ酸残基がApg4により切断され、その末端にGlyを有する細胞質型のLC3-Iとなる。オートファジーが誘導されると、このGlyにリン脂質が付加され、膜結合型のLC3-IIとなる。本キメラタンパク質を基質として、オートファジーが誘導される条件で培養したPC12細胞の細胞質成分と反応したところ、Sタグキメラタンパク質は、LC3-IおよびLC3-IIに変換されることが分かった。また、この反応が正確に起こっているかを調べるため、LC3の切断部位のGlyをAlaに置換したキメラタンパ質を作製して検討したところ、全く変換が進行しないことが分かり、Sタグ-キメラタンパク質はオートファジー活性の測定に応用できることが分かった。現在、各組織でオートファジー活性の測定をするために十分な量のリコンビナントタンパク質を作製すると共に、シグナルペプチドを持たない本キメラタンパク質をPC12細胞に発現して、細胞内でLC3-Iから-IIへの変換が生じるかも検討している。

In this study, we focused on the development of measurement methods for the determination of microtubule associate protein 1 light chain3(LC3), which is necessary for the determination of cellular tissue proteolytic activity. The N-terminal and C-terminal of GFP were added to LC3 (His S-LC3-GFP), and the S-terminal and C-terminal of GFP were added to LC3(His S-LC3-GFP). The development and purification of S-protein in culture supernatant of insect cells (fs-9) The cytoplasmic LC3-I was found in cells with 5 amino acid residues at the C-terminal and 4 amino acid residues at the C-terminal. The membrane binding type LC3-II is composed of the following lipid molecules: The cytoplasmic components of PC12 cells cultured in this medium were analyzed and compared with those of LC3-I and LC3-II. The Gly of the cut part of LC3 is replaced by the Gly of the cut part of LC3. The quality of the cut part is controlled by the Gly of LC3. The Gly of LC3 is replaced by the Gly of LC3. The Gly of LC3 is replaced by the Gly of LC3. The Gly of LC3 is replaced by the Gly of LC3. Now, the activity of each tissue is measured in ten minutes, and the quality of each tissue is controlled in one minute. The quality of each tissue is detected in PC12 cells, and the intracellular LC3-I-II transformation is discussed.

项目成果

Koike, M., Shibata, M., Ohsawa, Y., Nakanishi, H., Koga, T., Kametaka, S., Waguri, S., Momoi, T., Kominami, E., Peters, C., Figura, K.von, Saftig, S., Uchiyama, Y.: "Involvement of two different cell death pathways in retinal atrophy of cathepsin D-defici

小池 M.、柴田 M.、大泽 Y.、中西 H.、古贺 T.、龟高 S.、和栗 S.、桃井 T.、小南 E.、彼得斯 C.、

Waguri, S., Dewite, F., Borgne, R., Rouille, Y., Uchiyama, Y., Dubremetz, J.F., Hoflack, B.: "Visualization of TGN to endosomes trafficking through fluorescently labeled MPR and AP-1 in living cells"Miol.Biol.Cell. 14. 142-155 (2003)

Waguri, S.、Dewite, F.、Borgne, R.、Rouille, Y.、Uchiyama, Y.、Dubremetz, J.F.、Hoflack, B.：“通过荧光标记的 MPR 和 AP-1 对 TGN 进行内体运输的可视化

Suzuki, H., Yanaka, A., Shibahara, T., Matsui, H., Nakahara, A., Tanaka, N., Muto, H., Momoi, T., Y.Uchiyama: "Ammonia-induced apoptosis is accelerated at higher pH in gastric surface mucous cells"Am.J.Physiol.Gastrointest.Liver Physiol. 283. 986-995 (200

Suzuki, H.、Yanaka, A.、Shibahara, T.、Matsui, H.、Nakahara, A.、Tanaka, N.、Muto, H.、Momoi, T.、Y.Uchiyama：“氨诱导的细胞凋亡是

Kawane, K., Fukuyama, H., Yoshida, H., Nagase H., Ohsawa, Y., Uchiyama, Y., Nagaya, S.: "Impaired thymic development in mouse embryos deficient in apoptotic DNA degradation"Nature Immunology. 4. 138-144 (2003)

Kawane, K.、Fukuyama, H.、Yoshida, H.、Nagase H.、Ohsawa, Y.、Uchiyama, Y.、Nagaya, S.：“凋亡 DNA 降解缺陷的小鼠胚胎胸腺发育受损”《自然免疫学》。

Shibata, M., Koike, M., Waguri, S., Zhang, G., Koga, T., Uchiyama, Y.: "Cathepsin D is specifically inhibited by deoxyribonucleic acids"FEBS Letters. 157. 281-284 (2002)

Shibata, M.、Koike, M.、Waguri, S.、Zhang, G.、Koga, T.、Uchiyama, Y.：“组织蛋白酶 D 被脱氧核糖核酸特异性抑制”FEBS 快报。