赤血球酵素異常症の病因解明とモデルマウスを用いた新しい治療法の検討

利用模型小鼠阐明红细胞酶紊乱的发病机制并研究新的治疗方法

• 批准号: 07671225
• 负责人: 藤井 寿一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Tokyo Women's Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07671225/
• 关键词: 溶血性貧血; 赤血球酵素異常症; ピルビン酸キナーゼ異常症; モデルマウス; ミスセンス変異; 転写因子; トランスジェニックマウス; エリスロポエチン

CBAマウス純系コロニー内に自然発症した遺伝性溶血性貧血症の原因を明らかにするため、赤血球酵素活性および解糖中間体の測定、赤血球・肝臓抽出液のイムノブロット解析、肝臓抽出液のアイソザイム解析を行ない、この貧血がピルビン酸キナーゼ(PK)異常によることを決定した。次いでRACE法にてCBA系マウス骨髄mRNAからマウス赤血球(R)型PKcDNAクローニングを行い、得られた配列をもとに異常マウスの分子異常を解析した。PK異常マウスではR型PKの活性中心にG338D置換が明らかになり、活性中心の構造変化により基質親和性が低下し、赤血球内の生理的基質濃度におけるPK活性がほとんど消失したものと結論できた。このPK異常モデルマウスを用いて、赤血球酵素異常症の貧血に対する内因性エリスロポエチンの増加による代償作用の関与、薬理量のエリスロポエチン単独投与、ないしエリスロポエチンとbutyrateやhydorxyureaを用いて構造上正常な他のアイソザイムの強制発現による治療効果を検討する為に、今年度はPKのR型アイソザイムの細胞特異的発現調節機構を解明した。先ず、肝(L)型PK遺伝子上流のDNasel高感受性領域を検索し、次いでヒト遺伝子ライブラリーより単離したPK遺伝子クローンの塩基配列をR型PKの転写開始部位より約7kb上流まで決定した。その結果、PK遺伝子転写開始部位の上流約4kbに赤芽球系細胞特異的なDNasel高感受性領域を同定し、その領域の約700bp内に4つのGATA、4つのCACCC、さらに分化段階特異的転写因子NF-E4の認識配列を同定した。現在、ヒトL型遺伝子の第1・2エクソンおよびその5′上流域約8kbを含む遺伝子断片とヒトR型PkcDNAおよび3′領域約2.6kbに存在するAP-1サイトを用いて、ヒト赤血球型PKミニ遺伝子を構築し、PK異常マウスの受精卵に注入し、トランスジェニックマウスを作製している。

CBA is a pure natural disease in the heart, and the cause of hereditary hemolytic anemia is clearly identified. The determination of erythrocyte enzyme activity and glucose-hydrolysis intermediates, the analysis of erythrocyte and liver extracts, the analysis of liver extracts, and the determination of anemia acid (PK) abnormalities are discussed. The RACE method is used to analyze the molecular abnormalities of the (R)-type PKC gene. PK abnormality: R-type PK active center G338D replacement, active center structural change, matrix affinity decrease, physiological matrix concentration in erythrocytes, PK activity disappear. The relationship between compensation and increase of intrinsic stress in anemia due to abnormal PK, abnormal erythrocyte enzymes, and treatment effect of stress in structurally normal anemia due to abnormal PK, abnormal erythrocyte enzymes, and abnormal erythrocyte enzymes This year, the understanding of the cell-specific regulatory mechanisms of PK R-type gene expression was discussed. The DNasel high susceptibility domain of the upstream of the first and second type PK genes was detected, and the upstream of the second type PK gene was determined by the sequence of the upstream of the R-type PK gene. As a result, the recognition alignment of the PK gene coding initiation site was approximately 4 kb upstream of the red bud cell-specific DNasel hypersensitive domain, 4 kb of GATA, 4 kb of CACCC, and 4 kb of the differentiation segment-specific coding factor NF-E4 within the 700bp domain. Now, the 1.2-kb upstream region of the L-type gene contains about 8kb of gene fragments and the R-type Pk cDNA is about 2.6 kb in the 3-kb region, and there are AP-1 gene fragments in the 3-kb region. The erythrocytic PK gene is constructed, PK abnormalities are injected into the fertilized eggs, and the gene fragments are produced.

项目成果

Miwa S and Fujii H: "Molecular basis of erythroenzymopathies associated with hereditary hemolytic anemia: Tabulation of mutant enzymes." American Journal of Hematology. (in press).

Miwa S 和 Fujii H：“与遗传性溶血性贫血相关的红酶病的分子基础：突变酶列表。”

Kanno H, Morimoto M, Fujii H, Miwa S, et al.: "Primary structure of murine red cell type pyruvate kinase(PK) and molecular characterization of PK deficiency identified in the CBA strain." Blood. 86. 3205-3210 (1995)

Kanno H、Morimoto M、Fujii H、Miwa S 等人：“鼠红细胞型丙酮酸激酶 (PK) 的一级结构以及 CBA 菌株中鉴定的 PK 缺陷的分子特征。”

Morimoto M, Kanno H, Fujii H, Miwa S, et al.: "Pyruvate kinase deficiency of mice associated with nonspherocytic hemolytic anemia and cure of the anemia by marrow transplantation without irradiation." Blood. 86. 4323-4330 (1995)

Morimoto M、Kanno H、Fujii H、Miwa S 等人：“与非球形细胞溶血性贫血相关的小鼠丙酮酸激酶缺乏症以及通过无辐射骨髓移植治愈贫血。”

Hirono A, Fujii H and Miwa S: "Identification of two novel deletion mutations in glucose-6-phosphate dehydrogenase gene causing hemolytic anemia." Blood. 85. 1118-1121 (1995)

Hirono A、Fujii H 和 Miwa S：“鉴定出导致溶血性贫血的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶基因中的两个新缺失突变。”

Ohga S, Hirono A, Miwa S, Fujii H, et al.: "Haptoglobin therapy for acute favism: a Japanese boy with glucose-6-phosphate dehydrogenase Guadalajara." British Journal of Haematology. 89. 421-423 (1995)

Ohga S、Hirono A、Miwa S、Fujii H 等人：“急性蚕豆病的结合珠蛋白疗法：一名患有葡萄糖 6-磷酸脱氢酶瓜达拉哈拉的日本男孩。”