マラリア制圧に不可欠なグルコース・6ーリン酸脱水素酵素異常症の分子異常の同定

鉴定对于控制疟疾至关重要的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶疾病的分子异常

基本信息

批准号：
08281213
负责人：
藤井寿一
金额：
$ 1.47万
依托单位：
Tokyo Women's Medical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1996
资助国家：
日本
起止时间：
1996 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

グルコース-6ーリン酸脱水素酵素(G6PD)異常症は変異酵素によっはプリマキンなどの酸化作用を有する薬剤の服用後に溶血発作を来すため、マラリア制圧上重要な問題となっている。そこで、今年度は新しいG6PD異常症のスクリーニング法を開発した。先ず、DEAE-Sephadex、基質G6P、補酵素NADP、MTT、PMSを含む酵素反応チューブを作製する。これに全血5μlを加え、よく混和後、室温に静置する。G6PD活性が正常である場合は20〜40分後にDEAE-Sephadex層がブルーの色調を帯びてくるが、活性が正常の10%以下である場合は全く色調の変化が見られない。本法は手技が簡単で、多数検体の処理が可能で、特殊な装置が全く不要で、数十分でG6PD異常症の診断が可能である。従って、フィールドでマラリア治療薬投与の可否を日を改めずに決定することが可能となった。次いで、マラリアの流行地域であるパプアニューギニアにおけるG6PD異常症の分子異常を同定した。パプアニューギニアの295名(男性120、女性175、総数470アリル)の遺伝子DNAを抽出し、部分イントロン配列を含む全翻訳領域をPCR法にて増幅したのち、nonRI-SSCP法にて遺伝子変異のスクリーニングを行った。異常なSSCPパターンを示す部位は蛍光ヌクレオチドを用いる直接シークエンス法にて塩基配列を決定した。遺伝子解析の結果、(1)110T→C(37Met→Thr)変異1アリル、(2)IVS-2 37A A→G変異アリル、(3)243 C→T(81 Arg→Arg)変異2アリル、(4)1360 C→T(454 Arg→Cys)変異1アリル、(5)IVS-11 17G→A変異4アリルの5種類の単一塩基置換を同定した。1360 C→T変異は東南アジア〜メラネシアに広く分布する古い起源の変異酵素(G6PD Maewo)で、パプアニューギニアにも存在することが予想されたが、他は新しい変異である。

6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PD）异常是控制疟疾的重要问题，因为突变酶在服用氧化剂（如肾喹啉）后会引起溶血攻击。因此，今年我们开发了一种筛查G6PD疾病的新方法。首先，制备了含有Deae-Sephadex，底物G6P，辅酶NADP，MTT和PMS的酶促反应管。为此，加入5μL的全血，混合良好，然后将其留至室温。当G6PD活动正常时，Deae-Sephadex层将在20-40分钟后采用蓝色音调，但是当活动低于正常的10％时，颜色音调不会改变。此方法易于使用，可以处理大量标本，不需要任何特殊设备，并且可以在短短几分钟内诊断G6PD异常。因此，已经有可能决定是否应在野外服用疟疾治疗药物，而不会改变日期。接下来，确定了巴布亚新几内亚的G6PD异常的分子异常，这是一个疟疾末端的区域。提取了巴布亚新几内亚295人的基因DNA（120名男性，175名女性，总数470等位基因），并通过PCR扩增所有包含部分内含子序列的转化区域，然后使用非RI-SSCP方法筛选了基因突变。通过使用荧光核苷酸的直接测序方法确定显示异常SSCP模式的位点的基本序列。遗传分析揭示了五种类型的单碱基取代：（1）110t→C（37met→Thr）突变1烯丙基，（2）IVS-2 37A A→G突变1烯丙基，（3）243 C→T（81 arg→Arg）突变2 Allyl 2 allyl，（4）1360 c→560 c→454 Art→454 Art（4） IVS-111 17G→A突变4烯丙基。 1360 C-T突变是一种旧来源的突变酶（G6PD Maewo），该酶在东南亚广泛分布在Melanesia上，预计将存在于Papua New Guinea中，但其他人则是新的突变。