レトロウイルス逆転写酵素及び各種DNAポリメラーゼに対する光親和性標識試薬の開発

逆转录病毒逆转录酶和各种DNA聚合酶的光亲和标记试剂的开发

• 批准号: 07680639
• 负责人: 山口 十四文
• 金额: $ 1.02万
• 依托单位: Teikyo University of Science & Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07680639/
• 关键词: レトロウイルス; 逆転写酵素; DNAポリメラーゼ; 光親和性標識; ジアジリン; カルベン; ヒト免疫不全ウイルス; dTTP結合部位

DNAポリメラーゼ類の基質結合部位に反応する光親和性標識試薬の開発を目指した。1.dTTPアナログとしての、5-(p-(3-トリフルオロメチルジアジリン-3-イル)スチリル)-2′,3′-ジデオキシチミジン 5′-トリりん酸(TDSddUTP)を合成した。次に、鋳型・プライマーとしてポリA・オリゴdTを使用し、ヒト免疫不全ウイルス1型逆転写酵素(RT)について調べると、以下に示す成果が得られた。2.TDSddUTPの、暗所におけるRTの阻害は、dTTPに拮抗し、dTTPに比較して180倍強い親和性を示した。dTTPの5位へのスチリル基の導入はRTに対する親和性を高めることが明らかとなった。また、DNAポリメラーゼγに対しても高い親和性を示した。3.RTに対する光親和性標識実験を行うと、0.025mMマグネシウムイオン存在下、RTのdTTP結合部位に共有結合することが判明した。一方、4mMマグネシウムイオン存在下、TDSddUTPがプライマー3′末端に取り込まれ、光反応性オリゴデオキシヌクレオチドが生成し、光照射によって、プライマーがRTに共有結合した生成物を与えた。つまり、共存するマグネシウムイオン濃度によって、TDSddUTPは異なる挙動を示す光親和性標識試薬であることが判明した。いずれの標識実験においても、RTの66kDのサブユニットに結合した。この結果は、RTが66kDにポリメラーゼ触媒部位を有するという知見に合致する。以上のように、TDSddUTPは、RTの基質結合部位に反応することが判明し、RTのヌクレオチド結合部位のみならずDNA(プライマー)結合部位の構造および酵素学的研究に応用可能なプローブであることが明らかとなった。この方法論は、様々なDNAポリメラーゼに拡張可能であろう。

DNAポリメラ ゼ ゼ type <s:1> matrix binding site に anti-応 する light affinity marker drug test <s:1> development を finger た た. 1. DTTP ア ナ ロ グ と し て の, 5 - (p - (3 - ト リ フ ル オ ロ メ チ ル ジ ア ジ リ ン - 3 - イ ル) ス チ リ ル) - 2 ', 3 '- ジ デ オ キ シ チ ミ ジ ン 5' - ト リ り ん acid (TDSddUTP) を synthetic し た. Time に, where type プ ラ イ マ ー と し て ポ リ a. オ リ ゴ dT を use し, ヒ ト immune insufficiency ウ イ ル ス inverse planning write enzyme (RT) type 1 に つ い て adjustable べ る と, に が す results indicated below are ら れ た. 2.TDSddUTP, dark site におけるRT <s:1> resistance <e:1>, dTTPに antagonism <e:1>, dTTPに comparison <s:1> て180 times stronger <s:1> affinity を shows た た. DTTP の five へ の ス チ リ ル base の import は RT に す seaborne る affinity を high め る こ と が Ming ら か と な っ た. Youdaoplaceholder0 and DNAポリメラ また ゼ ゼγに have a high <s:1> affinity for を て ゼ を, which indicates を た. 3. RT に す seaborne る light affinity id be 験 を line う と, 0.025 mM マ グ ネ シ ウ ム イ オ ン presence, RT の dTTP combining site に mutual combination す る こ と が.at し た. Side, 4 mm マ グ ネ シ ウ ム イ オ ン presence, TDSddUTP が プ ラ イ マ ー 3 'end に take り 込 ま れ, light anti 応 オ リ ゴ デ オ キ シ ヌ ク レ オ チ ド が generated し, light に よ っ て, プ ラ イ マ ー が RT に mutual combination し た products を and え た. つ ま り, coexistence す る マ グ ネ シ ウ ム イ オ ン concentration に よ っ て, TDSddUTP は different な る 挙 dynamic を shown す light affinity id try 薬 で あ る こ と が.at し た. The ずれ ずれ identifier has the actual experience にお にお て て サブユニットに, RT <s:1> 66kD サブユニットに combined with <s:1> た. The results of う and RTが66kDにポリメラ にポリメラ ゼ ゼ of the ゼ catalyst site を and すると う う are combined to する. Above の よ う に, TDSddUTP は, RT の matrix inverse parts に 応 す る こ と が.at し, RT の ヌ ク レ オ チ ド combining site の み な ら ず DNA (プ ラ イ マ ー) combined with site の お よ び enzyme learning research に 応 may use な プ ロ ー ブ で あ る こ と が Ming ら か と な っ た. <s:1> methodology, sample 々なDNAポリメラ ゼに拡 ゼに拡 zhang possibly であろう.

项目成果

Toyofumi Yamaguchi et al.: "Photoaffinity labeling of HIV reverse transcriptase: utilization of 2′,3′-dideoxyuridylate analog bearingaryl(trifluoromethyl)diazirine moiety as a chain terminator." Nucleic Acids Symposium Series. 34. 75-76 (1995)

Toyofumi Yamaguchi 等人：“HIV 逆转录酶的光亲和标记：使用带有芳基（三氟甲基）二氮丙啶部分的 2,3-二脱氧尿苷酸类似物作为链终止剂。” 核酸研讨会系列 34. 75-76 (1995)。

T. Yamaguchi & M. Saneyoshi: "Synthetic nucleosides and nucleotides. XXXIV. Photoaffinity labeling of HIV reverse transcriptase: synthesis and utilization of 2′,3′-dideoxyuridylate analogs beaning aryl(trifluoromethyl)diazirine moiety." Nucleosides and Nu

T. Yamaguchi 和 M. Saneyoshi：“合成核苷和核苷酸。XXXIV. HIV 逆转录酶的光亲和标记：包含芳基（三氟甲基）二氮丙啶核苷和 Nu 的 2,3-二脱氧尿苷酸类似物的合成和利用。”