動脈硬化病変における酸化変性リポタンパクの動態の解明

阐明动脉粥样硬化病变中氧化脂蛋白的动态

• 批准号: 07807210
• 负责人: 山口 優
• 金额: $ 0.96万
• 依托单位: Mukogawa Women's University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1995
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1995 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-07807210/
• 关键词: 動脈硬化; 変性リポタンパク; HPLC; 過酸化脂質

申請者は高速液体クロマトグラフィ(HPLC)を用いてヒト、ウサギ、ラット及びマウスのリポタンパク及び変性リポタンパクの簡便な定義法を開発を試み、以下の知見を得た。1.カラムはDEAE-グルコマンナンゲルを、移動相はEDTAを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)及び500mM NaClを用いた。流速は1ml/min、カラム温度は25℃で行った。溶出液にコレステロール検出用酵素試薬にてポストカラム反応を行い、励起波長325nm、蛍光波長420nmで検出し、コレステロール含量で各リポタンパク値を算出した。勾配溶出法では、リポタンパク画分(HDL、LDL、VLDL)の部分的な分離しか得られなかったが、段階溶出法ではHDL、LDL、VLDLの完全な分離が得られた。本法により得られた各リポタンパク濃度は沈殿法及び超遠心法で得られた結果とよく一致した。本法では、1検体あたり20分以内でのリポタンパクの定量分析が可能で、再現性も良好であった。また、3種類のリポタンパクが完全に分離しているため、同一検体内のリポタンパク濃度が50倍以上異なる場合でも同時に定量可能であった。2.ウサギより得たLDLを5μM CuCl_2と1、3及び24時間と変えて培養し、変性度の異なるOx-LDLを得た。作製したOx-LDLは培養時間の長くなるほど過酸化脂質値が増大しアガロースゲル電気泳動法においても陽極側に強く移動していた。これらのOx-LDLをHPLCを用いて勾配溶出法で検討したところ保持時間が長くなり、段階溶出法においても変性度の強いものほど溶出に高濃度のNaClが必要であった。これらOx-LDLはいずれもN-LDLとの分離検出が可能であった。以上の結果より、申請者はHPLCによるリポタンパク及び変性リポタンパクの分離・定量法を開発することができた。本法は各リポタンパク及び変性リポタンパクを完全に分離定量することができるため、今後in vivoに応用することが可能であると考えられる。

The applicant has developed a simple method for the definition of high speed liquid chromatography (HPLC) by means of chromatography, chromatography, and chromatography. The following observations have been made. 1. DEAE-R-C buffer solution, mobile phase, EDTA buffer solution (pH 7.0) and 500mM NaCl buffer solution were used. Flow rate is 1ml/min, temperature is 25℃. The enzyme test for dissolution solution was carried out with excitation wavelength of 325nm and wavelength of fluorescence of 420nm, and the enzyme content of dissolution solution was calculated. Partial separation of HDL, LDL and VLDL by complexed stripping method and complete separation of HDL, LDL and VLDL by stepwise stripping method This method is used to determine the concentration and consistency of the particles. This method has a good reproducibility and is suitable for quantitative analysis within 20 minutes 3 species are separated completely. When the concentration of the species in the same sample is more than 50 times different, it is possible to quantify simultaneously. 2. Ox-LDL was obtained at 5μM CuCl_2 at 1, 3 and 24 hours after incubation. Ox-LDL was incubated for a long time, and the lipid value increased due to the strong migration on the anode side of the cell. For Ox-LDL, HPLC is used to investigate the high concentration of NaCl in the complexed dissolution method, and the high concentration of NaCl in the stepwise dissolution method is necessary. The separation of Ox-LDL and N-LDL is possible. The above results show that the applicant has developed a separation and quantitative method for HPLC analysis. This method is suitable for all kinds of applications.

项目成果

Haginaka, J., Yamaguchi, Y.: "Anion-Exchange High-Performance Liquid Chromatographic Assay of Plasma Lipoproteins." Anal. Biochem.232. 163-171 (1995)

Haginaka，J.，Yamaguchi，Y.：“血浆脂蛋白的阴离子交换高效液相色谱测定。”

Yamaguchi, Y. et al: "Different cholesterol deposition in aorta of Dahl salt-sensitive rats and spontaneously hypertensive rats fed a high-cholesterol diet." Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.22. 249-250 (1995)

Yamaguchi, Y. 等人：“在喂食高胆固醇饮食的达尔盐敏感大鼠和自发性高血压大鼠的主动脉中，胆固醇沉积情况不同。”