動脈硬化病変における酸化変性リポタンパクの動態の解明

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申請者は高速液体クロマトグラフィ(HPLC)を用いてヒト、ウサギ、ラット及びマウスのリポタンパク及び変性リポタンパクの簡便な定義法を開発を試み、以下の知見を得た。1.カラムはDEAE-グルコマンナンゲルを、移動相はEDTAを含む50mMリン酸緩衝液(pH7.0)及び500mM NaClを用いた。流速は1ml/min、カラム温度は25℃で行った。溶出液にコレステロール検出用酵素試薬にてポストカラム反応を行い、励起波長325nm、蛍光波長420nmで検出し、コレステロール含量で各リポタンパク値を算出した。勾配溶出法では、リポタンパク画分(HDL、LDL、VLDL)の部分的な分離しか得られなかったが、段階溶出法ではHDL、LDL、VLDLの完全な分離が得られた。本法により得られた各リポタンパク濃度は沈殿法及び超遠心法で得られた結果とよく一致した。本法では、1検体あたり20分以内でのリポタンパクの定量分析が可能で、再現性も良好であった。また、3種類のリポタンパクが完全に分離しているため、同一検体内のリポタンパク濃度が50倍以上異なる場合でも同時に定量可能であった。2.ウサギより得たLDLを5μM CuCl_2と1、3及び24時間と変えて培養し、変性度の異なるOx-LDLを得た。作製したOx-LDLは培養時間の長くなるほど過酸化脂質値が増大しアガロースゲル電気泳動法においても陽極側に強く移動していた。これらのOx-LDLをHPLCを用いて勾配溶出法で検討したところ保持時間が長くなり、段階溶出法においても変性度の強いものほど溶出に高濃度のNaClが必要であった。これらOx-LDLはいずれもN-LDLとの分離検出が可能であった。以上の結果より、申請者はHPLCによるリポタンパク及び変性リポタンパクの分離・定量法を開発することができた。本法は各リポタンパク及び変性リポタンパクを完全に分離定量することができるため、今後in vivoに応用することが可能であると考えられる。