破骨細胞の小胞輸送に関与する新規遺伝子の同定とその機能

１）Rab44結合タンパク質の同定一般的にRabタンパク質には多くのエフェクタータンパク質が結合して機能する。特に破骨細胞では、極性輸送を示すことから、新規のタンパク質と結合する可能性も十分考えられた。そこでRab44タンパク質に結合するタンパクを同定するために、まず内在性タンパク質について免疫沈降法を行った後、質量分析法を用いて相互作用する分子を同定した。幸い、2分子が同定できた。まだ発表段階ではないためここではその分子の名称は割愛する。なお、結合する可能性が示された分子は再度もう一方に分子の抗体を用いて免疫沈降法で確認している。２）Rab44遺伝子欠損マウスの作成本遺伝子の生体内での機能を探るべく遺伝子欠損マウスを作製し、解析を試みた。作製は既に理化学研究所生体ゲノム工学研究チームに協力を依頼し、CRISPR/Cas9による迅速な作製方法で実行している。受精卵に注入したsgRNA/Cas9 が標的遺伝子の片方もしくは両方のアレルを切断すると変異マウスが得られる。両アレルが破壊された場合には，欠損ホモマウスとなる。卵割したのちにCas9が標的配列を切断するとモザイクマウスが生まれるため区別できる。ホモマウスが誕生したので解析してみるとRab44の発現レベルは若干ではあるが検出できた。詳細な理由は不明であるが、遺伝子の欠失が不完全であったようである。そこでもう一度、全Rab44遺伝子を欠失できるように欠失領域を再設計して、マウスを再作製した。現在はそのヘテロマウスが誕生して、今後はヘテロ同士で交配させる予定である。

１）Rab44結合タンパク質の同定一般的にRabタンパク質には多くのエフェクタータンパク質が結合して機能する。特に破骨細胞では、極性輸送を示すことから、新規のタンパク質と結合する可能性も十分考えられた。そこでRab44タンパク質に結合するタンパクを同定するために、まず内在性タンパク質について免疫沈降法を行った後、質量分析法を用いて相互作用する分子を同定した。幸い、2分子が同定できた。まだ発表段階ではないためここではその分子の名称は割愛する。なお、結合する可能性が示された分子は再度もう一方に分子の抗体を用いて免疫沈降法で確認している。２）Rab44遺伝子欠損マウスの作成本遺伝子の生体内での機能を探るべく遺伝子欠損マウスを作製し、解析を試みた。作製は既に理化学研究所生体ゲノム工学研究チームに協力を依頼し、CRISPR/Cas9による迅速な作製方法で実行している。受精卵に注入したsgRNA/Cas9 が標的遺伝子の片方もしくは両方のアレルを切断すると変異マウスが得られる。両アレルが破壊された場合には，欠損ホモマウスとなる。卵割したのちにCas9が標的配列を切断するとモザイクマウスが生まれるため区別できる。ホモマウスが誕生したので解析してみるとRab44の発現レベルは若干ではあるが検出できた。詳細な理由は不明であるが、遺伝子の欠失が不完全であったようである。そこでもう一度、全Rab44遺伝子を欠失できるように欠失領域を再設計して、マウスを再作製した。現在はそのヘテロマウスが誕生して、今後はヘテロ同士で交配させる予定である。