機能性食肉タンパク質・ペプチドの微生物大量発現系の構築

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本研究は、熟成中の食肉の軟化機能を有するパラトロポミオシンおよびパラトロポミオシンと相互作用するコネクチンタンパク質の遺伝子を微生物に導入、大量発現させる系を確立することを目的に行われた。昨年度までパラトロポミオシンがサルコメアA-I接合部で結合するコネクチン43断片領域をコードする遺伝子の一部をクローニングし、その塩基配列を決定後、同断片を構成する2ドメインを大腸菌中に組換えタンパク質として発現させ、精製した。本年度は、43断片をコードする遺伝子の全塩基配列決定と全構成ドメインの大腸菌での発現と精製を試み、昨年度までの結果と合わせて以下の成果が得られた。1.パラトロポミオシンが結合する鶏胸筋コネクチン43kDa断片をコードする全塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定した。すなわち1849bpの塩基配列決定から615アミノ酸配列を推定し43kD断片を構成するドメイン中I51〜I54ドメインはfibronectin type-3 domainで、またA1ドメインはimmunoglobulin domainであることを明らかにした。2.43kDa断片を構成する各ドメインを、個々に組換えタンパク質として大腸菌中に発現させ、ゲルろ過法および疎水性相互作用クロマトグラフィー法で精製した。3.抗I53ドメイン抗体を作成し、鶏筋原線維と反応させ間接免疫蛍光法で調べた結果、A-I接合部に蛍光を認めた。これらの結果、パラトロポミオシンが結合するコネクチン43kDa断片がサルコメアA-I接合部に位置することを明確に示し、43kDa断片をコードする遺伝子領域の大腸菌での発現から、発現した組換えタンパク質精製までの系を確立し、個々のコネクチンドメインとパラトロポミオシンとの相互作用分析のための基礎を築いた。これらの研究成果をまとめ、学術雑誌への投稿を準備中である。