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機能性食肉タンパク質・ペプチドの微生物大量発現系の構築

功能性肉蛋白和肽微生物质量表达系统的构建

基本信息

批准号：
14656099
负责人：
山之上稔
金额：
$ 2.11万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2004
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究は、熟成中の食肉の軟化機能を有するパラトロポミオシンおよびパラトロポミオシンと相互作用するコネクチンタンパク質の遺伝子を微生物に導入、大量発現させる系を確立することを目的に行われた。昨年度までパラトロポミオシンがサルコメアA-I接合部で結合するコネクチン43断片領域をコードする遺伝子の一部をクローニングし、その塩基配列を決定後、同断片を構成する2ドメインを大腸菌中に組換えタンパク質として発現させ、精製した。本年度は、43断片をコードする遺伝子の全塩基配列決定と全構成ドメインの大腸菌での発現と精製を試み、昨年度までの結果と合わせて以下の成果が得られた。1.パラトロポミオシンが結合する鶏胸筋コネクチン43kDa断片をコードする全塩基配列を決定し、アミノ酸配列を推定した。すなわち1849bpの塩基配列決定から615アミノ酸配列を推定し43kD断片を構成するドメイン中I51〜I54ドメインはfibronectin type-3 domainで、またA1ドメインはimmunoglobulin domainであることを明らかにした。2.43kDa断片を構成する各ドメインを、個々に組換えタンパク質として大腸菌中に発現させ、ゲルろ過法および疎水性相互作用クロマトグラフィー法で精製した。3.抗I53ドメイン抗体を作成し、鶏筋原線維と反応させ間接免疫蛍光法で調べた結果、A-I接合部に蛍光を認めた。これらの結果、パラトロポミオシンが結合するコネクチン43kDa断片がサルコメアA-I接合部に位置することを明確に示し、43kDa断片をコードする遺伝子領域の大腸菌での発現から、発現した組換えタンパク質精製までの系を確立し、個々のコネクチンドメインとパラトロポミオシンとの相互作用分析のための基礎を築いた。これらの研究成果をまとめ、学術雑誌への投稿を準備中である。

The aim of this study was to establish a system for the introduction and mass production of meat softeners during ripening. After determining the base alignment of all fragments, the same fragments are formed into two groups in Escherichia coli, and the quality is developed and refined. This year, 43 fragments of DNA were identified and the following results were obtained. 1. Determination of the total nucleotide sequence and estimation of the nucleotide sequence of the 43kDa fragment of the protein The 1849bp nucleotide sequence was determined from 615 bp to 43kD fragment composition. I51 ~ I54 fragments were identified in the fibronectin type-3 domain and in the immunoglobulin domain. 2.43 kDa fragment composition, composition, and purification of the protein in Escherichia coli 3. Anti-I53 antibody preparation, anti-I53 antibody preparation, anti- The results showed that the 43kDa fragment was located at the A-I junction. The 43 kDa fragment was found in the E. coli sub-domain. The system of quality purification was established. The basis of interaction analysis was established. Research results, academic journals and contributions are being prepared.