ES細胞の組織分化誘導による胎生期再生医学

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本年度は、昨年度に引き続き、注入用ES細胞株としてenhanced-green fluorescent protein遺伝子導入ES細胞を用いた。子宮外発生法によりES細胞をマウス胚へ導入し、導入後の細胞の生着とその後の動態について検討した。昨年確立した手技・条件に従い、妊娠13日および16日のJcl:ICRマウス胎児、各腹につき4から6匹に、数十から数百個のES細胞を50-100μm径のガラスミクロピペットを用いて注入した。注入部位としては、昨年検討した前肢芽皮下、脳室、眼に限定して、さらに検討を進めた。導入後、子宮外発生法にて発生を継続させた後、妊娠18日に胎児を得た。細胞を注入した胎児の生存率は、昨年までと同様に高率であった。胎児を実体顕微鏡下にUV灯下で肉眼的に観察し、蛍光を確認できる個体を確認した。しかし、肉眼にて確認が困難な例も多く、さらに実験個体の切片を作成し、抗EGFP抗体を用いて免疫染色することが解析の過程に必要であることが確認された。注入時のマーカーを目印にして免疫染色を施すことにより導入ES細胞の各部での生着が確認された。ES細胞の生着は、注入個体のほぼ全例に認められ、導入手技そのものは再現性をもって使用可能であることが確認された。EGFP陽性細胞の光学顕微鏡下での純形態学的観察では、現在までのところ明確な分化を示す細胞は確認できていない。今後、分化マーカーによる導入ES細胞の分化の詳細な検討と、さらに導入時期の早期化や成長因子などとの同時注入実験などによる分化促進を試みる必要がある。