オーファン受容体リガンドの新しい高感度アッセイ法による探索

使用新的高灵敏度检测方法寻找孤儿受体配体

• 批准号: 14657021
• 负责人: 木村 定雄
• 金额: $ 2.18万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657021/
• 关键词: GPCR; 生理活性ペプチド; ゲノム構造; リガンド; リガンド予測; Gタンパク質共役受容体; オーファン受容体; ボンベシン受容体

本研究は、独自のGPCRリガンドライブラリー作製と新しいアッセイ方法を導入し、新規生理活性ペプチドリガンドを探索することを目的とする。平成15年度は、(1)ゲノム構造Bankに登録されたDNA構造を用いて、1)独自のコンピューター「検索プログラム」により、ゲノム情報からG蛋白質共役受容体(GPCR)のリガンドとなる生理活性ペプチド候補を網羅的に抽出し、(2)994個の活性ペプチド候補をすべて化学合成し、(3)多数のGPCRを内在的に発現する細胞(組織)に作用させて特異的及び非特異的活性測定による新規GPCRリガンドのスクリーニングを行った。このGPCRペプチド性リガンド候補の化学合成は、生体内に微量しか存在しない生理活性ペプチドを大量に合成して、従来のGPCR刺激後の細胞内の下流シグナルを増幅するのど対照的な受容体上流の増幅を試みるものであり、強度のシグナルを生じ、精度よくGPCRリガンドを同定することが可能である(ペプチドゲノミクス解析の試み)。非特異的活性測定法として、オーファンGPCRを発現させた細胞や約20種類の種々の細胞に蛍光指示薬fura-2/AMを取り込ませ、ペプチドリガンド候補による細胞内Ca濃度変化を蛍光細胞内Caシグナル測定装置により96個同時に測定した.また、血管平滑筋、輸精管、回腸平滑筋などの組織をマグヌス管法にて種々の濃度のペプチドの収縮・弛緩を測定した。その結果、ゲノム構造から予測したリガンド候補994個の合成ペプチドより、総計34種類の既知ペプチドを検出した。一方、新規活性ペプチド3種類を検出した。現在、その新規活性ペプチドの遺伝子を取得し、生体内組織分布の解析および機能解析を行っている。

This study aims to introduce a novel method for the control of GPCR activity and explore new physiological activity parameters. In 2015,(1) DNA structures registered in the Structure Bank were used;(1) independent search engine search (3) Most GPCRs are produced in cells (tissues) and function in both specific and non-specific activity assays. Chemical synthesis of the GPCR candidate is carried out in small amounts in vivo, physiological activity is carried out in large amounts, and the downstream of the cell after GPCR stimulation is increased. Amplitude of the upstream of the target receptor is tested in different ways, such as generation, intensity, and accuracy. Non-specific activity assays were performed on about 20 species of cells, and 96 simultaneous assays were performed on 96 cells using a light indicator fura-2/AM. The concentration and relaxation of the vascular smooth muscle, vas deferens and ileum smooth muscle were determined by the method of tissue culture. As a result, 994 synthetic candidates were selected from among the 34 known candidates. A party, a new activity, a new activity, a new activity. Now, the new regulation of activity of the gene to obtain, in vivo tissue distribution analysis and functional analysis of the process.

项目成果

Takanami-Ohnishi Y, Amano S, Kimura S, Asada S, Utani A, Maruyama M, Osada H, Tsunoda H, Irukayama-Tomobe Y, Goto K, Karin M, Sudo T, Kasuya Y: "Essential role of p38 mitogen-activated protein kinase in contact hypersensitivity"J. Biol. Chem.. 277. 37896-

Takanami-Ohnishi Y、Amano S、Kimura S、Asada S、Utani A、Maruyama M、Osada H、Tsunoda H、Irukayama-Tomobe Y、Goto K、Karin M、Sudo T、Kasuya Y：“p38 丝裂原的重要作用-

Sato M, Moroi K, Nishiyama M, Zhou J, Usui H, Kasuya Y, Fukuda, M, Kohara, Y, Komuro, I, Kimura, S: "Characterization of a novel C. elegans RGS protein with a C2 domain-Evidence for interaction between C2 domain and Galfaq subunit-"Life Sciences. (印刷中). (

Sato M，Moroi K，Nishiyama M，Zhou J，Usui H，Kasuya Y，Fukuda，M，Kohara，Y，Komuro，I，Kimura，S：“具有 C2 结构域的新型秀丽隐杆线虫 RGS 蛋白的表征 - 证据用于 C2 结构域和 Galfaq 亚基之间的相互作用 -“生命科学。（正在出版）。

Sato M, Moroi K, Nishiyama M, Zhou J, Usui, H, Kasuya Y, Fukuda M, Kohara Y, Komuro I, Kimura S: "Characterization of a novel C. elegans RGS protein with a C2 domain - Evidence for interaction between C2 domain and Galfaq subunit"Life Sciences. 73. 917-93

Sato M、Moroi K、Nishiyama M、Zhou J、Usui、H、Kasuya Y、Fukuda M、Kohara Y、Komuro I、Kimura S：“具有 C2 结构域的新型线虫 RGS 蛋白的表征 - 之间相互作用的证据