関節に対するin vivoエレクトロポレーション法を応用した遺伝子導入法の検討

将体内电穿孔方法应用于关节的基因转移方法的检验

• 批准号: 14657374
• 负责人: 久保 俊一
• 金额: $ 2.05万
• 依托单位: Kyoto Prefectural University of Medicine
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Exploratory Research
• 财政年份: 2002
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2002 至 2003
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-14657374/
• 关键词: 遺伝子治療; エレクトロポレーション; 関節炎; 非ウイルス性遺伝子導入; EBV; in vivo; 関節

非致死性である関節疾患の遺伝子治療には、導入法の安全性がより重要である。本研究では非ウイルス性導入法であるin vivoエレクトロポレーション法に着目し、関節内組織への有効性・安全性について検討した。さらにプラスミドDNAとしてEpstein-Barr virus(EBV)由来の構造を有するEBVプラスミドベクターを用い、その効果を検討した。Dark Agouti(DA)ラットの膝関節内に、luciferase遺伝子を組み込んだEBV由来の構造を有するプラスミド(GEG.GL3)または有しないプラスミド(G.GL3)を50μg投与した。直後、関節に皮膚上から様々な電圧(25〜500V)のパルスを加え、3日後に関節内組織におけるluciferase活性を測定した。またGFP遺伝子を組み込んだEBVプラスミドベクター(GEG.EGFP)50μgを同様に投与後150Vのパルス刺激を加え、3日後に導入遺伝子発現の局在を蛍光顕微鏡視下に確認した。G.GL3、GEG.GL3投与群ともに電圧が高くなるに従い滑膜組織における発現は強くなり、ともに150Vの際に最も高率であった。GEG.GL3投与群では、電気刺激を加えないnaked DNA投与のみの群と比較して、約800倍の導入効率であった。またGEG.GL3投与群ではG.GL3の約10倍の効率が得られた。組織学的には、GEG.EGFP投与群では滑膜に遺伝子発現を認めたが、軟骨・靭帯・半月板にはほとんど認めなかった。ラット関節腔内に注入したプラスミドDNAに対しin vivoエレクトロポレーション法を応用することで、滑膜に対する遺伝子導入の増強が可能であった。また、EBVプラスミドベクターを組み合わせることで、より高率な導入遺伝子発現が得られた。本法は関節疾患に対する有用な遺伝子導入法になると考える。今後、本法を遺伝子発現阻害法のひとつとして注目されているshort interference RNA(siRNA)の関節内導入について検討する予定である。

The cultural heritage of non-fatal である joint disorders 伝 is used for treatment に, and the safety of the introduction method <s:1> is がよ and <s:1> important である. This study で は non ウ イ ル ス import method で あ る in vivo エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン method に tissues in the mesh し, masato へ の have sharper, safety に つ い て beg し 検 た. さ ら に プ ラ ス ミ ド DNA と し て Epstein - Barr virus get (EBV) origin の tectonic を す る EBV プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー を い, そ の unseen fruit を beg し 検 た. Dark Agouti (DA) ラ ッ ト の knee masato section within に group, luciferase but 伝 を み 込 ん だ EBV origin の a す を construction る プ ラ ス ミ ド (GEG. GL3) ま た は have し な い プ ラ ス ミ ド G.G (L3) を cast with 50 mu g し た. On the skin after the straight section, masato に か ら others 々 な electric 圧 (25 ~ 500 v) の パ ル ス を え, 3 future に masato tissues in section に お け る を luciferase activity determination し た. ま た GFP posthumous son 伝 を group み 込 ん だ EBV プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー (GEG. EGFP) 50 mu g を with others に with the 150 v の パ ル ス stimulus を え, 3 に import in the future but 伝 son 発 now の bureau in を 蛍 light 顕 micro mirror under に confirm し た. G.G L3, GEG. GL3 cast and group of と も に electric 圧 が high く な る に 従 い synovial tissue に お け る 発 now strong は く な り, と も に interstate 150 v の に most も high rate で あ っ た. GEG. GL3 cast and group of で は, electric 気 stimulate を え な い cast with naked DNA の み の group と compare し て, about 800 times の import working rate で あ っ た. Youdaoplaceholder0 GEG.GL3 throws with the group で で G.GL3 <s:1> approximately 10 times the <s:1> efficiency が gets られた. Histological に は, GEG. Cast and EGFP group で は synovial に heritage 伝 son 発 を now recognize め た が, cartilage 靭 帯 · meniscus に は ほ と ん ど recognize め な か っ た. ラ ッ ト masato section に cavity injection し た プ ラ ス ミ ド DNA に し seaborne in vivo エ レ ク ト ロ ポ レ ー シ ョ ン method を 応 with す る こ と で, synovial に す seaborne る heritage 伝 son import の raised strong が may で あ っ た. ま た, EBV プ ラ ス ミ ド ベ ク タ ー を group み close わ せ る こ と で, よ り high rate な import legacy 伝 son 発 が must now ら れ た. This method uses the な seed 伝 introduction method になると to examine える for する related disorders に. In the future, this law を but 伝 発 now resistance against law の ひ と つ と し て attention さ れ て い る short interference RNA (siRNA) の masato section to import に つ い て beg す 検 る designated で あ る.

项目成果

Suzuyo Ohashi: "Successful genetic transduction in vivo into synovium by means of electroporation."Biochemical and Biophysical Research Communications. 293,5. 1530-1535 (2002)

Suzuyo Ohashi：“通过电穿孔在体内成功地将基因转导到滑膜中。”生物化学和生物物理研究通讯。

Tsunao Kishida: "Sequence-specific gene silencing in murine muscle induced by electroporation-mediated transfer of short interfering RNA"The Journal of Gene Medicine. 6,1. 105-110 (2003)

Tsunao Kishida：“电穿孔介导的短干扰 RNA 转移诱导小鼠肌肉中的序列特异性基因沉默”基因医学杂志。