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関節疾患に対する遺伝子治療における新しいベクターの開発

关节疾病基因治疗新载体的开发

基本信息

批准号：
10877229
负责人：
久保俊一
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Kyoto Prefectural University of Medicine
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

项目摘要

われわれはすでにin vitroにおいて培養軟骨細胞に対し、非増殖型アデノウイルスベクターを用いて外来遺伝子導入を行い、導入遺伝子が高率にかつ長期間発現することを確認し、アデノウイルスベクター法が高度に分化した非増殖型細胞に対しても有効であることを証明した。また直接関節内にアデノウイルスベクターを投与した場合滑膜細胞へは高率に遺伝子導入が可能であったが、軟骨細胞へは十分な遺伝子導入高率が得られなかった。その要因として軟骨周囲の豊富な基質が通過障害因子となっていることが考えられる。そこでアデノウイルスベクターの大きさ80nmに対しさらに小さいベクターの開発が必要である。そこで直径が20nmのアデノウイルス関連ベクター(AAV)を用いて、関節に対する応用の可能性を検討した。骨腫瘍患者の手術時または人工関節置換術時に得られたヒト関節軟骨から軟骨細胞を単離し、平板培養を行った。サイトメガロウイルスプロモーターからGreen Fluorescent Protein(GFP)を発現するAAVベクターを構築し、軟骨細胞に対し遺伝子導入を行った。導入遺伝子後、軟骨細胞に489nmの励起光を照射し、緑色光の発光を蛍光顕微鏡をもちいて確認し、発現している軟骨細胞の割合について検討を行った。初代培養軟骨細胞に対する遺伝子導入効率は、遺伝子導入1日後では16%であったが、遺伝子導入7日後には95%に増加した。基質に囲まれた軟骨細胞に対しては深層の細胞まで十分に遺伝子導入でき、遺伝子導入効率は54%であった。さらに導入した遺伝子の発現は28日間持続した。これらの結果からAAVベクターは、軟骨細胞に対する遺伝子導入法として優れたベクターであることが明らかになった。また関節内に直接AAVベクターを投与するin vivo遺伝子導入法に応用することで、深層に至るまで軟骨細胞に遺伝子発現が得られる可能性が高い。

This study was conducted to confirm the high rate of foreign gene introduction and long-term development in cultured chondrocytes in vitro and to demonstrate the effectiveness of the method for highly differentiated non-genotypic chondrocytes. In the case of direct intraarticular injection, synovial cells have a high rate of gene introduction, while chondrocytes have a high rate of gene introduction. The main reason for this is that the rich matrix around the cartilage cannot pass through the barrier factors. For example, the development of a small satellite is necessary at 80nm. This paper discusses the possibility of using a joint to connect the joint to the joint when the diameter of the joint is 20nm The cartilage cells were isolated and cultured in plate during the operation of artificial joint replacement in patients with bone tumors. The expression of Green Fluorescent Protein(GFP) in chondrocytes and the construction of AAV cells After introduction of chondrocytes, chondrocytes were irradiated with excitation light at 489nm, green light was emitted, and microscopes were used to confirm and detect chondrocytes. The rate of gene introduction in primary cultured chondrocytes increased from 16% to 95% after gene introduction 1 day and 7 days respectively. The rate of gene transfer was 54%. Today's introduction of the virus has been ongoing for 28 days. The results of this study are as follows: AAV, chondrocyte, gene introduction method, and optimal gene introduction method. The possibility of gene expression in cartilage cells from deep to deep is high.