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上皮幹細胞を用いた自家培養口腔粘膜の短期間で高能率な作製法の開発

利用上皮干细胞开发自体培养口腔粘膜的快速高效生产方法

基本信息

批准号：
14657468
负责人：
田中輝男
金额：
$ 1.66万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2002
资助国家：
日本
起止时间：
2002 至 2003
项目状态：
已结题

项目摘要

生後1〜3日の新生児ラットから口腔粘膜(頬粘膜)を採取した。口腔粘膜上皮を粘膜固有層から分離するために、ディスパーゼ処理を施し、その後、ピンセットにて、上皮を慎重に剥離した。口腔粘膜固有層の組織片をαMEM中で十分に細切して、ストレーナーで、余分な組織を除去したのち、カルチャーディッシュに播種した。10%FBS添加αMEMにて、約80%程度のサブコンフルエントな状態にまで培養すると、酵素処理にて線維芽細胞を剥離し、6代まで継代培養した。増殖させた線維芽細胞を、コラーゲンゲル内で培養した。しかしながら、コラーゲンゲルを種々の厚さにして培養した場合、その厚みが増すと、3次元的な線維芽細胞の培養を行っている途中で、細胞の増殖が停滞・ときには細胞死が生じた。コラーゲンゲルの厚みの検討を現在行っているため、技術的に十分な培養口腔粘膜固有層の作製には至ってない。次に、分離した口腔粘膜上皮を用いて、上皮底面を機械的に擦り、上皮細胞を多く分離させた後、上皮細胞専用の無血清培地にて分離培養した。種々の表面抗原をマーカーにして、FACSにて、上皮幹細胞の単離に挑戦した。しかしながら、1度に採取できる上皮幹細胞の数が少ないためか、分離してきた細胞が組織幹細胞として、的確でなかったためか、上皮細胞が十分にシート状に培養できなかった。口腔上皮から分離した上皮細胞を、上述のコラーゲンの上で培養すると、シート状の培養上皮は作製可能であったが、2〜3週間必要で、その大きさが小さいため、培養上皮シートの迅速かつ大量な作製を目指した本研究の目的には適していなかった。現在、上皮幹細胞のFACSによる分離・培養法を検討中である。

1 ~ 3 days after birth, the oral mucosa (buccal mucosa) is taken. Oral mucosa epithelium is separated from mucosa propria by careful peeling after treatment. The tissue slice of the oral mucosa proper is very fine cut, and the rest of the tissue is removed. 10% FBS added αMEM, about 80% of the cells were cultured in vitro, and the cells were cultured in vitro for 6 generations. The growth and development of embryonic cells In the process of culture, cell growth stagnated and cell death occurred. The culture of oral mucosa proper layer is the most important part of oral mucosa culture. The oral mucosa epithelium was isolated and cultured in serum-free medium. The epithelial cells were cultured in serum-free medium. Cell surface antigen, FACS, and epithelial stem cell isolation The number of epithelial stem cells is small, the number of isolated epithelial cells is small, and the number of epithelial cells is small. Oral epithelium is isolated from epithelial cells and cultured in vitro. Cultured epithelial cells may be prepared within 2 to 3 weeks. Cultured epithelial cells may be prepared rapidly and in large quantities. Now, epithelial stem cells FACS isolation and culture methods are discussed.