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水晶体培養細胞中のD-アミノ酸含有タンパク質及びストレス誘導タンパク質の解析

培养晶状体细胞中含 D-氨基酸的蛋白质和应激诱导蛋白质的分析

基本信息

批准号：
15651095
负责人：
藤井紀子
金额：
$ 2.43万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
2003
资助国家：
日本
起止时间：
2003 至 2005
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-15651095/
关键词：
水晶体培養細胞 D-アスパラギン酸ラセミ化異性化 D-アミノ酸水晶体

项目摘要

目的:申請者らは最近、水晶体培養細胞NN1003Aの産生するタンパク質中にD-β-アスパラギン酸(D-β-Asp)が存在することを発見した。これまでに種々の代謝の緩慢な老化組織(水晶体、脳、皮膚、歯など)ではD-β-Aspが見いだされているが、分裂の盛んに行われている培養細胞中でのD-β-Aspを含むタンパク質の報告は全くない。本研究ではこれらのタンパク質を同定することを目的とした。方法と結果:水晶体培養細胞NN1003Aを大量に培養し、タンパク質画分を抽出し、2次元電気泳動にかけ、以前我々の調製したD-β-Asp含有ペプチド特異抗体を用いてwestern blottingを行った。その結果、水晶体培養細胞NN1003A中に複数のD-β-Asp含有タンパク質が発現していることが明らかとなった。これらのタンパク質をゲル内酵素処理し、質量分析、タンパク質データベース解析によって同定した。その結果、Calponin H2,ラミン、エノラーゼ、αB-クリスタリンなど10種類のD-β-Asp含有タンパク質が同定された。本研究により微量のD-β-Asp含有タンパク質を同定する手法が確立した。従来の研究で、我々はタンパク質中でのD-β-Asp生成は酵素に依存せず、Asp残基が5員環イミドを形成し、これを介してラセミ化、異性化をするというメカニズムを明らかにした。本反応はAsp残基がイミド形成をしやすいか、しにくいかが、driving forceとなっている。Asp残基のイミド形成はAspの隣接残基がアラニン、グリシン、セリンのような立体障害の小さいアミノ酸の場合は起こりやすいので、この様なアミノ酸残基が隣に位置しているときはラセミ化、異性化が生じやすい環境といえる。本研究で新たに見出した上記のD-β-Asp含有タンパク質のどの残基のAspが反転異性化しているか、周辺の構造はどのようなものなのかを追跡することが重要と考えられた。

Objective: To explore the existence of D-β-Asp in the production of NN1003A cells cultured in vitro. This is a report of D-β-Asp content in cultured cells from slow-metabolizing aging tissues (lens, skin, teeth). The purpose of this study is to determine the quality of the product. Methods: NN1003A crystal culture cells were cultured in large quantities, and the protein was extracted by two-dimensional electrophoresis, and the protein was modulated by D-β-Asp containing specific antibody. As a result, the crystal culture cells NN1003A contain a plurality of D-β-Asp molecules. The quality of the product is determined by enzyme treatment, quality analysis, and quality analysis. Results, Calponin H2, In this study, we established a method for the determination of trace amounts of D-β-Asp. In recent studies, the production of D-β-Asp in the protein is dependent on enzymes, and Asp residues are formed in 5-membered rings. This anti-Asp residue forms a driving force. Asp residues form adjacent residues of Asp, such as those in adjacent positions, such as those in adjacent positions and those in adjacent positions. In this study, it was found that D-β-Asp contains the residue of Asp, which is characterized by anti-heterogeneity, and the structure of Asp.