神経認識分子A5と相互作用する因子の検出

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神経認識分子A5と相互作用する因子を検出する第一ステップとして,本年度は以下の実験を行った.1.ニワトリA5分子のcDNAクロ-ニングアフリカツメガエルA5分子のcDNAをプロ-ブとしてラムダgt11,ZAPニワトリ胚脳cDNAライブラリ-をスクリ-ニングしてニワトリA5分子のcDNA全長をクロ-ニングした.全塩基配列を決定し,ニワトリA5分子はアフリカツメガエルA5分子と全長にわたって高い相同性を示すことを明らかにした.また,in situ hybridizationを行い,mRNAが視蓋,海馬等に局在している事を明らかにした.2.ニワトリA5分子に対する抗体の作成.原核生物の発現ベクタ-(Studierらによって開発された大腸菌ーpETの系)を用いて,ニワトリcDNAからニワトリA5分子断片の合成を試みた.三種類の蛋白断片を合成したが,このうち二種類については可溶化できず,抗体産生もみられなかった.残り一種類について抗体作成に成功した.これを抗原としてモルモット,マウスから抗血清を作成した.この抗血清はニワトリ胚脳組織切片に結合し,結合パタンはニワトリA5分子mRNAの分布と一致していた.また,この抗血清はニワトリcDNAをトランスフェクションしたCOS細胞にも結合した.当初は,膜貫通部分を欠損させたニワトリA5分子をCOS細胞にトランスフェクションして分泌型A5分子を合成させて,これを抗原として用いる予定であったが,精製が難しく断念した.