個体レベルのストレスに対する白血球細胞の反応

白细胞对个体压力的反应

• 批准号: 04670342
• 负责人: 高垣 裕
• 金额: $ 0.9万
• 依托单位: Osaka Prefectural Institute of Public Health
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04670342/
• 关键词: ストレス; 白血球細胞

1.細胞の培養および熱ショックによるストレス蛋白質の発現ヒト前骨髄球性白病細胞株HL-60を10%FCS添加RPMI-1640mediumで培養し、それぞれ37、42、50℃で2時間1×10^7cells/mLの濃度で処理した。それらの細胞を5×10^7cells/mLの濃度でLeupeptin(10μg/mL)、PepstatinA(10μg/mL)、PMSF(1.0mM)を含む10mM CHAPS/50mM Tris-HOAc,pH7.5(4℃)を用いて可溶化した。さらに不溶物を遠心分離(15,000rom、30分)し、その上清をSDS-PAGEにかけた。その結果、50℃では蛋白質の発現の抑制が顕著に観察されたが、42℃においては37℃と差異が認められなかった。そこでストレス蛋白質と考えられているSuperoxidedismutase(SOD)の発現量を観察する事にした。2.マウスモノクローナル抗ストレス蛋白質(SOD)抗体の作製精製したストレス蛋白質(Cu,Zn-SOD)を純系マウス(A/J,Female)に免疫し、そのspleen cellsと骨髄腫細胞(X63-Ag8-6.5.3)をポリエチレングリコールで融合させ、ヒポキサンチン、アミノプテリン、サイミジンにより融合細胞を選択的に増殖させた後、細胞上清中の抗ストレス蛋白質(SOD)抗体をスクリーニングした。さらに抗体陽性ウエルから、限界希釈法によりクローニングして抗体産生細胞を得た。3.ウエスタンブロッテイング法を用いた熱ショックによるストレス蛋白質(SOD)発現の観察抗SOD(Cu,Zn)抗体で検出されるバンドが一つ観察され、その分子量は16.7kダルトンであった。また42℃の発現量は37℃のそれの約130%であった。抗SOD(Mn)抗体で検出されるバンドは認められなかった。4.ヒト白血球中のストレス蛋白質(Cu,Zn-SOD)の測定ウエスタンブロッテイング法を用いてストレス蛋白質(Cu,Zn-SOD)を測定するために現在いろいろなストレス状態にあるヒトの白血球を採取しているところである。

1. Cell culture and protein development before osteoblastic leukaemia cell line HL-60 was cultured in 10% FCS supplemented with RPMI-1640medium at 37 ℃, 42 ℃ and 50℃ for 2 hours at 1× 10^7 cells/mL. The cells were solubilized in the presence of Leupeptin(10μg/mL), PepstatinA(10 μ g/mL) and PMSF(1.0 mM) at a concentration of 5× 10^7 cells/mL in the presence of 10mM CHAPS/50mM Tris-HOAc at pH 7.5 (4℃). The insoluble substances were separated remotely (15,000 rom, 30 min) and the supernatant was separated by SDS-PAGE. As a result, protein production was inhibited at 50℃, and the difference was observed at 42℃ and 37℃. The amount of superoxide dismutase (SOD) detected in the serum was significantly lower than that in the control group. 2. Preparation and purification of SOD antibody (Cu,Zn-SOD) pure line (A/J,Female) Immune, spleen cells and osteoma cells (X63-Ag8 -6.5.3) are fused, isolated, and fused. Cells are selected for proliferation, and anti-spleen protein (SOD) antibodies are present in cell supernatants. Antibody-positive cells were identified by the method of limiting antibody production. 3. The detection of anti-SOD (Cu,Zn) antibody by using the method of "anti-SOD" protein (SOD) detection, the molecular weight of which is 16.7k. The emission at 42℃ is about 130% lower than that at 37℃. Anti-SOD (Mn) antibodies were detected in the serum. 4. Determination of protein (Cu, Zn-SOD) in white blood cells.