筋萎縮性側索硬化症の脊髄前角でのカルシトニン遺伝子関連ペプチドの蓄積機序の解明

阐明肌萎缩侧索硬化症患者脊髓腹角降钙素基因相关肽的积累机制

• 批准号: 04670482
• 负责人: 加藤 丈夫
• 金额: $ 0.83万
• 依托单位: Yamagata University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1992
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1992 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04670482/
• 关键词: 筋萎縮性側索硬化症; カルシトニン遺伝子関連ペプチド; in situハイブリダイゼーション; ビオチン化オリゴヌクレオチド

孤発性筋萎縮性側索硬化症(ALS)の腰髄前角でのカルシトニン遺伝子関連ペプチド(CGRP)mRNAの発現をin situハイブリダイゼーション法を用いて調べた。方法:ALS8例、非ALS5例の腰髄を剖検時に急速凍結し、凍結切片(10μm)を作成した。切片は4%パラフォルムアルデヒドで5分間固定後、エタノール→クロロフォルムにて脱脂し、プローブと12時間反応(38℃)させた。尚、プローブとの反応前に40μg/mlのProteinase K(37℃、10分間)処理および非処理の2通りの方法を行なった。プローブとして、DNA合成装置で合成した30塩基オリゴヌクレオチド(CGRPmRNAに対してアンチセンスおよびセンス)をPhotoprobe^<(] SY.encircledR. [)>biotin(Vector)でビオチン化し、ブタノールルおよびエタノール沈殿にて回収したものを0.2μg/ml in hybridization bufferの濃度で用いた。発色反応にはストレプトアビジンアルカリフォスファターゼ→NBT・BCIPを用いた。プローブのビオチン化を確認するため、ニトロセルロース膜に5pg/μl〜50ng/μlのプローブおよび非ビオチン標識オリゴヌクレオチドを各1μlずつドットし、上記の方法にて発色させた。結果:Dot blottingにて、全てのドットで濃度依存性に陽性反応を呈した。非ビオチン標識オリゴヌクレオチドは呈色されなかった。ALSおよび対照例の腰髄を用いたi situハイブリダイゼーションではALS2例、対照例1例でProteinase K処理しアンチセンスプローブを用いた切片で陽性反応を呈した。陽性反応は前角細胞核周部に認められた。他の例では陽性反応は認められなかった。考察:ヒト剖検例の腰髄を用いてCGRPmRNAのin situハイブリダイゼーションが可能であることがわかった。しかし、その検出感度は死後時間や組織の死後変化の程度に大きく依存すると思われ、CGRPmRNAの発現の程度を症例間で比較することは困難と思われた。

The expression of CGRP mRNA in the lumbar anterior horn of ALS was modulated by a novel method. Methods: 8 cases of ALS and 5 cases of non-ALS were dissected by rapid freezing and frozen sections (10μm) were prepared. After 5 minutes of fixation, the sections were defatted and defatted for 12 minutes at 38℃. Protein K 40μg/ml (37℃, 10 min) and non-treatment 2-pass method were used. The DNA assembly is composed of 30-mer DNA fragments (CGRP mRNA) and Photoprobe^<(] SY.encoredR. [)>Biotin(Vector) is used in the concentration of hybridization buffer at 0.2μg/ml. In the development process, Satoshi Profile →NBT·BCIP is available. The color of the film is 5pg/μl ~ 50ng/μl, and the color of the film is 1μl each. Results:Dot blotting was positive in concentration-dependent manner. The color of the logo is not visible. ALS is the most common disease in the world. The positive reaction is to recognize the perinuclear part of the anterior horn cell. He is a man of the same gender. To investigate whether CGRP mRNA can be used in different tissues, it is necessary to study the relationship between CGRP mRNA and CGRP. The sensitivity of CGRP mRNA depends on the time after death and the degree of tissue transformation.