嫌気条件における遺伝情報の転写制御機構

厌氧条件下遗传信息转录控制机制

基本信息

批准号：
04680193
负责人：
山本勇
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Hiroshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04680193/
关键词：
嫌気条件遺伝子発現転写制御 torR 大腸菌

项目摘要

大腸菌の染色体DNAを制限酵素で切断後、プラスミッドpUC118に組み込んでtorR遺伝子をクローン化した(pKS7)が、3.4キロ塩基対(kbp)の染色体DNA断片が組み込まれている。torR突然変異を持つHM177株をpUC118およびpKS7で形質転換した後、SDS‐ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分析した結果、2種類のタンパク質がコードされていた。即ち、TMAO呼吸培養で最も強く、次いで硝酸呼吸培養、発酵培養でも合成されるが酸素呼吸では合成されない52kDaタンパク質と、上記4つの培養条件で等しく合成される27kDaタンパク質である。エクソヌクレアーゼIIIを用いたデレッションで何れかのタンパク質を合成できないプラスミッドを作成した結果、52kDaタンパク質を発現するプラスミッドpKS7D3のみがHM177株のtorR変異を回復した。硝酸還元酵素の遺伝子オペロンnarGHJIなどの2成分系転写調節因子をコードするnarXとnarLのlacZ融合遺伝子をHM177株に形質導入し、さらにpKS7で形質転換して作成した株は、narX‐lacZ、narL‐lacZともに硝酸呼吸条件でのみX‐galを分解した。即ち、TorRタンパク質はnarXLオペロンの転写制御に働くことを示している。52kDaのTorRタンパク質は対数増殖の後期に入ると合成量が少なくなり、torR遺伝子の転写を自己制御している可能性が高い。従って、上記のpKS7DはTorRタンパク質の大量生産に使えなかった。今後の研究方向として、3.4kbpのDNA上に適当な制限酵素切断部位が見つからないため、部位特異的変異を導入して自己制御領域を破壊することにより蛋白の大量生産を可能にし、精製タンパク質の性質を当初の計画通りに解明したい。

将大肠杆菌染色体DNA用限制酶切割后，将Torr基因掺入质粒PUC118（PKS7）中，然后克隆了Torr基因（PKS7），该基因掺入了3.4千焦酶对（KBP）染色体DNA片段。用PUC118和PKS7转化用TORR突变转换菌株HM177后，通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行了分析，并编码了两种类型的蛋白质。也就是说，它是一种52 kDa蛋白，在TMAO呼吸道培养物中最强烈合成，然后在硝酸盐呼吸道培养和发酵培养物中，而不是在氧气呼吸道呼吸中，而在上述四个培养条件下则是同样合成的27 kDa蛋白。由于创建了无法通过使用外切核酸酶III合成任何蛋白质的质粒，仅表达52KDA蛋白的PKS7D3恢复了HM177菌株中的TORR突变。通过转导Narx和Narl的LACZ融合基因而产生的菌株，该菌株编码了两个组分的转录调节剂，例如硝酸还原酶基因基因操纵子Narghji，然后用PKS7转换它们，仅在硝酸盐呼吸条件下降解X-GAL。也就是说，这表明托尔蛋白作用于Narxl操纵子的转录调节。 52KDA Torr蛋白进入对数生长的后期，并且很可能自我调节Torr基因的转录。因此，上述PKS7D不能用于大规模生产托尔蛋白。作为未来的研究方向，由于在3.4 kbp DNA上找不到适当的限制酶切割位点，因此我们将引入定位的突变以破坏自我调节区域，从而允许蛋白质的大量产生，并且我们希望阐明纯化的蛋白质的特性是最初计划的。