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酵素蛋白のlipoylation機構に関する研究

酶蛋白脂酰化机制研究

基本信息

批准号：
04680197
负责人：
本川雄太郎
金额：
$ 1.28万
依托单位：
The University of Tokushima
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1992
资助国家：
日本
起止时间：
1992 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-04680197/
关键词：
リポ酸転移酵素リポ酸 H-protein グリシン開裂酵素系

项目摘要

グリシン開裂酵素系はP‐,H‐,L‐proteinから構成され,グリシンをテトラヒドロ葉酸とNAD^+存在下メチレンテトラヒドロ葉酸,炭酸ガス,アンモニアに分解する反応を触媒する.構成蛋白質のうちH‐proteinはリポ酸を配合族として持つ分子量14kDaの耐熱性蛋白質であり,反応はそのリポ酸がP‐,T‐,L‐proteinの活性中心と順次接触することによって進行する.リポ酸を持つ酵素は他に2‐オキソ酸脱水素酵素復合体のE2が良く知られている.これらの蛋白質にリポ酸を結合させる反応を触媒するリポ酸転移酵素の詳細はこれ迄不明であった.我々はリポ酸結合反応の基質となるアポ型H‐proteinを大腸菌に発現させそれを用いて酵素をウシ肝から部分精製しその性質を検討した.ウシH‐protein前駆体cDNAから成熟型をコードする断片を切出し,発現ベクターpET‐3aに組込んだ.これを大腸菌BL21(DE3)pLysSに導入しH‐proteinを産生させたところ,得られたH‐proteinの80%がリポ酸を特たぬアポ型であったので,これを単一に迄精製し基質として用いた.リポ酸転移酵素は肝ミトコンドリアに局在するので,ミトコンドリア抽出液からhydroxulapatite,MonoQ colymn等を本科学研究費補助金で購入したインテリジェントイナートポンプに接続してクロマトグラフィーを行い精製した.酵素は非常に不安定で精製を進めると失活が著しく,現在のところ完全な精製には至っていない.反応でリポ酸供与体となるのはlipoyl‐AMPであり,リポ酸とATPを用いた場合はリポ酸転移は起らないので,酵素はリポ酸活性化反応は触媒しない.リポ酸がアポH‐proteinと結合したことは,反応終了後P‐proteinと組合せるとグリシンと^<14>CO_2の交換活性が出現することで測定した.またアポ型とホロ型はポリアクリルアミド電気泳動上易動度が異るので,リポ酸の結合はこりによっても判定することが出来る.

The cleavage enzymes are P-,H-,L-protein cleavage enzymes that catalyze the degradation of folic acid and NAD^+ in the presence of folic acid and NAD^+. H-protein, which constitutes a protein, is a heat-resistant protein with a molecular weight of 14kDa. The active center of P-,T-,L-protein is contacted sequentially. The E2 complex of the enzyme complex is well known. The details of this protein binding enzyme are still unknown. We have studied the properties of H-protein in E. coli, which is produced by enzyme in the presence of H-protein. H-protein precursor cDNA fragments were cut out from mature cDNA fragments to reveal the sequence of pET-3a. E. coli BL21 (DE3)pLysS was introduced to produce 80% of the H-protein. In the past few years, the company has made great efforts to improve the quality of its products, such as hydroxyapatite,MonoQ colymn, etc. Enzymes are unstable, refined, inactivated, and now completely refined. In the case of reverse acid transfer, the enzyme is activated by reverse acid. The activity of CO_2 exchange was determined after the termination of P-protein <14>binding. The electrophoresis mobility varies between different types of molecules, and the binding of molecules is determined.