放射線や活性酸素による遺伝子発現の誘導とその生物学的意義に関する研究

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Mud(Ap、lac)ファージ感染菌からスーパーオキサイドで誘導される融合遺伝子(soi-lacZと名付けた)を持つ8種類の変異株を分離した。これらの遺伝子は、マッピングされた大腸菌遺伝子地図上での位置からこれまでに未発見の遺伝子であることが分かった。しかも、これらの変異株はいずれもスーパーオキサイド増産剤であるメナジオンやメチルビオロゲンに高感受性であるので、酸化的ストレスに対する新しい防護酵素の発見につながる可能性が高い。そこで、まずこれらの遺伝子のクローニングを行った。第一段階で、これらの融合遺伝子をMuから溶原化したλファージ中に転換させた。これによって、λファージはマイトマイシンCによって容易に誘導される。このファージ粒子からDNAを抽出すれば、その中にsoi-lacZが含まれている。このDNAを標識してプローブDNAを作製した。このプローブDNAとハイブリドを形成しうる配列を、クラーク・カーボン遺伝子バンクから検索し、soi10および12遺伝子は、pLC8-9に存在することが分かった。さらに、種々の制限酵素でpLC8-9を切断、サザーンハイブリダイゼーションを行ったところ、soi10/12遺伝子はそのEcoRV2.5KbのDNAフラグメントに存在することが確かになった。この2.5Kbフラグメントを持つプラスミドの産生タンパクをマキシセル法で調ベた。soi10/12遺伝子産物は約32KDaのタンパクであった。さらに、このプラスミドをsoi10/12-lacZ変異株に導入すると、変異株のメナジオン高感受性は相補された。この事実は、2.5Kbフラグメントには明らかにsoi10/12遺伝子が含まれていることを示している。この2.5Kbのデリーションセットを作製して個々のヌクレオチド配列をダイデオキシ法で決定した。2.5Kbフラグメントには32KDaのタンパクをコードするORFが含まれていた。