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シアリルトランスフェラーゼのゴルジ体局在化とその機構

唾液酸转移酶的高尔基体定位及其机制

基本信息

批准号：
06672191
负责人：
野元裕
金额：
$ 1.02万
依托单位：
Gifu Pharmaceutical University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞内でのタンパク質の選別輸送や特定の部位での保持機構の解明を目的として、トランスゴルジからTGN(トランスゴルジネットワーク)にかけて分布するα2-6シアリルトランスフェラーゼに注目し、ターゲットシグナルとされる膜貫通領域を含むペプチドと酵素ペルオキシダーゼの融合タンパク質を発現する新たな方法で解析を行った。(1)融合タンパク質の発現:シアリルトランスフェラーゼのN末端より膜貫通領域までのcDNA配列をPCR法により合成した(細胞質領域9残基、膜貫通領域17残基、膜腔内19残基)。これのC末側にHRPのcDNAをつなぎ、発現ベクターpSRαに組み込んだ。このプラスミドを、エレクトロポレーション法で、ヒト上皮細胞由来HEp2細胞や、サル腎臓由来COS7細胞にトランスフェクトした。(2)細胞内における局在:DABを基質としたHRP反応、および抗HRP抗体を用いる免疫蛍光法により、融合タンパク質がゴルジ体と考えられる領域に局在することを確認した。また、レクチンのWGAは核膜とトランスゴルジからTGNにかけて結合するが、DAB反応後には後者の染色のみ特異的に消失することから、融合タンパク質がトランスゴルジからTGNにかけて存在することを確認した。さらに、その局在はDAB反応後の電子顕微鏡による観察からも確認された。(3)融合タンパク質の細胞内代謝:^<35>S-メチオニンを用いたパルス-チェイス実験から、融合タンパク質は2つの分子量の異なる分子種として存在し、最初に出現するのは分子量約50Kの分子であるが、この分子は半減期約1時間で消失し、その一部が分子量約64Kの安定な分子に変化することがわかった。酵素活性は64K分子のみに観察された。また、エンドグリコシダーゼHに対する反応性から、50K分子は糖鎖のプロセシングを受けていないERタイプであることが判明し、フォールディングが不十分なためほとんどがERで分解されていると考えられる。(4)ゴルジタンパク質の保持に関与するタンパク質の検索:キメラタンパク質のHRP部分をマーカーとして、免疫沈降、化学的架橋などの手法でキメラタンパク質と相互作用するタンパク質を検索中。

In the cell, you can choose to send a specific part of the cell to the maintenance machine to explain the purpose, the purpose, the TGN, the distribution, the distribution, the attention, the attention. In the field of membrane communication, there is a new method for the analysis of the field of the membrane. The main results are as follows: (1) the fusion method shows that the N-terminal membrane has the ability to communicate with each other, and the PCR method has been used to synthesize it (cell domain 9 residues, membrane domain 17 residues, membrane cavity 19 residues). At the end of the day, you will need to HRP the cDNA to make sure that the pSR alpha is not available. HEp2 cells, epithelial cells, COS7 cells, epithelial cells and epithelial cells. (2) the detection of anti-HRP and anti-HRP antibodies in DAB cells was confirmed by immunophotochemistry and fusion. The results show that there is a confirmation that there is a positive effect on the nuclear membrane of the nuclear membrane, WGA, nuclear membrane, TGN, nuclear membrane, nuclear membrane, nuclear membrane, After the DAB counter-attack, the police and the bureau made a micro-inspection to confirm the situation. (3) Fusion of intracellular generation: ^ & lt;35&gt The molecular weight is about 50 K, the molecular weight is about 50 K, the half-life of the molecule disappears in about 1 time, and the molecular weight is about 64 K. The enzyme activity was detected by 64K molecule. The molecular weight of 50K sugar is different from that of ER. It is found that it is not clear that it is not very clear that it is not very good. It is not very important to know that it is not very important to know that there is a difference between the two groups. (4) to keep the virus in place and to keep it in contact with the others. The cable: the part of the HRP, the immunoprecipitation, the chemical scaffold, the manipulation, the interaction, the interaction.