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Xenopus卵を用いたDNA複製の制御機構に関する研究

利用非洲爪蟾卵研究DNA复制控制机制

基本信息

批准号：
06680575
负责人：
室伏擴
金额：
$ 1.47万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
财政年份：
1994
资助国家：
日本
起止时间：
1994 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.Xenopus卵のDUF(DNA untwisting/unwinding factor)の小サブユニット(96kDa)に対するモノクローン抗体を調整した。この抗体を用いた新しいXenopus DUFの精製法を確立した。2.DUFの小サブユニットに対する抗体を用いて、Xenopusの培養細胞A6を染色した。その結果、DUFは主として核に存在することがわかった。3.Xenopus卵抽出液に、除膜した精子頭部を添加すると、卵抽出液中のDUFは精子核と結合して、形成された核構造体中に取り込まれることがわかった。4.環状一本鎖DNAにオリゴヌクレオチドをアニールさせた基質を調整し、DUFの持つDNAヘリカーゼの性質を調べ、以下の結果を得た。オリゴヌクレオチドの3′端に一本鎖部分を持つ基質に対するヘリカーゼの活性は高かったが、5′端に一本鎖部分を持つ基質、および一本鎖部分を持たない基質に対する活性は低いことがわかった。このことから、DUFのDNAヘリカーゼの方向性はSV40のT-抗原の持つヘリカーゼとは逆に、5′端から3′端方向であることがわかった。DUFのDNAヘリカーゼはATPあるいはdATP存在下で活性を示し、他のNTPおよびdNTP存在下での活性は低かった。5.Xenopus DUFはcdc2/cyclinBおよびDNA依存プロテインキナーゼによってリン酸化され、特に、後者によってDNAヘリカーゼ活性が亢進することがわかった。6.Xenopus DUFの小サブユニットのcDNAクローニングを行い(現在進行中)、このサブユニットがHMGボックスを持つタンパク質であることを見いだした。7.DUFの小サブユニットに対する抗体を用いて、ラット腹水肝がんAH7974細胞からDUF類似タンパク質を精製した。その結果、AH7974細胞のDUF小サブユニット類似タンパク質はXenopusのものよりも小さい分子量(55kDa)を持ち、他の11種類のタンパク質と安定な複合体を形成していることがわかった。

1. The DUF(DNA untwisting/unwinding factor) of Xenopus eggs is regulated by the antibody to the small protein (96kDa). The purification method of Xenopus DUF was established. 2. DUF cells were stained with antibodies against Xenopus A6 cells. As a result, DUF is the main reason for this. 3. Xenopus egg extract, sperm head addition, DUF sperm nucleus binding, formation of nuclear structure in the extract 4. The following results were obtained by adjusting the properties of cyclic DNA and DUF. The activity of the substrate is high at the 3′ end and low at the 5′ end. The DNA of DUF has the directionality of SV40 and the T-antigen has the directionality of SV40 and the 5′ end has the directionality of SV 40. DUF DNA is active in the presence of ATP, and active in the presence of NTP. 5. Xenopus DUF has cdc2/cyclin B and DNA dependent protein, and DNA dependent protein has a high activity. 6. Xenopus DUF is currently in progress (in progress), and its cDNA library is currently in progress (in progress). 7. DUF antibody was purified by using DUF-like antibody in AH7974 cells. As a result, the DUF of AH7974 cells has a small molecular weight (55kDa) similar to that of Xenopus, and 11 kinds of DUF complexes have been formed.