Xenopus卵を用いたDNA複製開始機構の研究

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DNA Untwisting/Unwinding Factor(DUF)は、二重鎖DNAに負のひねりを加え、かつ二重鎖を巻き戻すことによって、in vitroでDNA複製を開始させる因子として、筆者らによってXenopus卵抽出液から単離された。この因子は、140kDaと96kDaの2種のサブユニット1:1から成る。これまでの研究で、96kDaサブユニット(DUF96)の全アミノ酸配列を決定し、これがマウスT160(V(D)J組換えのシグナル配列に結合する因子)およびヒトSSRP1(抗癌剤シスプラチン付加によって修飾されたDNAに結合する因子)と高い類似性を有することを明らかにした。本研究では、140kDaサブユニット(DUF140)の全アミノ酸配列を決定した。さらに、DUF140に対する抗体を作成し、DNA複製に対する効果を見た。(1)DUF140は出芽酵母のCDC68と約30%の類似性を持ち、N-末端近くには、DNAヘリカーゼモチーフと似た配列が、C-末端付近には酸性アミノ酸に富む部分と核移行シグナルと考えられる塩基性アミノの連続配列が存在することが分かった。(2)E.coli内で発現させたDUF140の部分フラグメントを抗原として、抗-DUF140抗体を作成した。この抗体を用いてXenopus卵無細胞抽出液からDUFを除くと、抽出液のDNA複製活性が顕著に減少することが分かった。また、この抗体を用いてXenopus培養細胞A6を染色すると、低密度で増殖中の細胞は、核が強く染色されたが、高密度の細胞では核の染色が減少することが分かった。このことは、DUF量が細胞増殖能と密接に関連することを示唆する。さらに、増殖中のA6細胞では、かなり顕著な核小体の染色が見られ、DUFが核小体中での転写にも関与する可能性が示唆された。