腫瘍性タンパク質Skp2の量的制御を司る幹細胞腫瘍化抑制機構の包括的解析

様々ながん組織において過剰発現を認め、幹細胞腫瘍化への寄与が示唆される腫瘍性タンパク質Skp2に関して、そのユビキチン-プロテアソーム系による量的制御を担うと考えられる上流のRING型E3ユビキチンリガーゼ(RING#BI)を同定し、RING#BI によるSkp2分解の腫瘍化抑制における役割について解析してきた。まず、RING#BIによるSkp2のユビキチン化に関する分子制御機構を明らかにするため、Skp2に対するRING#BIの結合領域の同定を試みた。欠失変異体を用いた解析より、RING#BIはSkp2のN末端領域で結合し、Skp2のユビキチン化・分解に必須の領域であることが明らかとなった。また、Skp2の既知上流E3として知られるCdh1はSkp2のD-boxを介してユビキチン化することが報告されているが、本課題においてRING#BIによるSkp2のユビキチン化にD-boxは不要であることが明らかとなった。この知見をもとに、RING#BIに特異的なSkp2の時間・空間的制御について検討を進めている。さらに、Skp2がRING#BIの生理的な基質であることを証明するにあたり、CRISPR-Cas9システムを用いてRING#BIのノックアウト細胞株を樹立し、Skp2及びSkp2の基質の発現量を検証した。その結果、RING#BIノックアウト細胞においてSkp2の発現量は上昇し、それに伴いSkp2基質の発現量が低下することを確認した。また、RING#BIノックアウト細胞は、DNAダメージによるアポトーシス誘導に抵抗性を示し、さらに、細胞増殖の促進が認められることから、細胞レベルにおいてRING#BIの腫瘍化抑制因子としての機能を見出すことができた。

様々ながん組織において過剰発現を認め、幹細胞腫瘍化への寄与が示唆される腫瘍性タンパク質Skp2に関して、そのユビキチン-プロテアソーム系による量的制御を担うと考えられる上流のRING型E3ユビキチンリガーゼ(RING#BI)を同定し、RING#BI によるSkp2分解の腫瘍化抑制における役割について解析してきた。まず、RING#BIによるSkp2のユビキチン化に関する分子制御機構を明らかにするため、Skp2に対するRING#BIの結合領域の同定を試みた。欠失変異体を用いた解析より、RING#BIはSkp2のN末端領域で結合し、Skp2のユビキチン化・分解に必須の領域であることが明らかとなった。また、Skp2の既知上流E3として知られるCdh1はSkp2のD-boxを介してユビキチン化することが報告されているが、本課題においてRING#BIによるSkp2のユビキチン化にD-boxは不要であることが明らかとなった。この知見をもとに、RING#BIに特異的なSkp2の時間・空間的制御について検討を進めている。さらに、Skp2がRING#BIの生理的な基質であることを証明するにあたり、CRISPR-Cas9システムを用いてRING#BIのノックアウト細胞株を樹立し、Skp2及びSkp2の基質の発現量を検証した。その結果、RING#BIノックアウト細胞においてSkp2の発現量は上昇し、それに伴いSkp2基質の発現量が低下することを確認した。また、RING#BIノックアウト細胞は、DNAダメージによるアポトーシス誘導に抵抗性を示し、さらに、細胞増殖の促進が認められることから、細胞レベルにおいてRING#BIの腫瘍化抑制因子としての機能を見出すことができた。