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ヒトiPS細胞由来肝細胞による肝不全に対する革新的治療法の開発・展開

使用人 iPS 细胞来源的肝细胞开发和部署肝衰竭的创新治疗方法

基本信息

批准号：
18H06245
负责人：
武石一樹
金额：
$ 1.91万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2018
资助国家：
日本
起止时间：
2018-08-24 至 2020-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18H06245/
关键词：
iPS細胞肝不全人工肝臓人工臓器

项目摘要

患者本人の細胞から肝細胞を作成し、移植することができれば、肝移植におけるドナー不足や拒絶反応などの問題を解決でき、肝不全に対する革新的な治療法になり得る。iPS細胞は多分化能を持ち、肝不全に対する人工肝細胞のもとになる可能性があるが、現在までに臨床応用可能となったiPS細胞由来肝細胞は存在しない。今回の目的は、iPS細胞を分化させ、iPS由来肝細胞を作成し、その肝細胞も肝不全モデル動物に細胞移植することで、iPS由来肝細胞が肝不全に対して、生体内で治療効果を有するかどうかを明らかにすることである。まず、iPS細胞株の樹立を行うこととした。ヒト肝切除検体より線維芽細胞を取り出し、その線維芽細胞に山中遺伝子を導入することで、ヒトiPS細胞を3種類作成し、培養の定型化を行った。作成したiPS細胞が幹細胞の特徴を有することをNanog、OCT3/4の免疫染色およびqPCRにてその発現を評価することで、確認した。このヒトiPS細胞の多分化能を評価するため、3D培養をおこなうことで、外胚葉、中胚葉、内胚葉に分化する能力を持っていることを免疫染色にてそれぞれ確認した。つぎにiPS細胞の内胚葉への分化を行うために、内胚葉への導入を行った。Activin、BMP4、FDF2の濃度を振り分けて、4日間培養し、最も分化効率が良かった濃度を同定した。この導入効率を確認するために、内胚葉の分化マーカーである。SOX17の発現量を免疫組織化学染色、qPCRにて確認した。この内胚葉を肝芽細胞に分化するため、HGFにて刺激を行った。このHGFの至適濃度を確認するため、濃度を振り分けて実験を行った。肝芽細胞に分化させた細胞は、アルブミン、HNF4Aの発現を認めた。

The patient's own cells are prepared for transplantation, and the problem of liver transplantation is not solved. The innovative treatment method for liver insufficiency is obtained. iPS cells are capable of multiple differentiation, liver failure, and the possibility of artificial liver cells being used clinically. The goal of this study is to differentiate iPS cells, to create iPS-derived hepatocytes, to transplant iPS-derived hepatocytes into animals with liver failure, and to treat liver failure in vivo. The establishment of iPS cell lines is a matter of concern. 3 types of iPS cells were prepared, cultured, and characterized. The characteristics of iPS cells were evaluated by Nanog, OCT3/4 immunostaining and qPCR. The ability of iPS cells to differentiate into multiple cells was evaluated in 3D culture and confirmed by immunostaining for the ability to differentiate into ectoblast, mesoblast and endoblast. The differentiation and introduction of endoblast in iPS cells Activin, BMP4 and FDF2 concentrations were determined at the same time. The rate of introduction was confirmed, and the differentiation of endosperm was confirmed. SOX17 expression was confirmed by immunohistochemical staining and qPCR. The differentiation of endoblast and liver bud cells was stimulated by HGF. The optimum concentration of HGF was determined by the method of quantitative analysis. The differentiation of liver bud cells was studied by cell culture and HNF4A expression.