過剰歯由来iPS細胞によるバイオリサイクル研究システムの研究

利用多余的牙源iPS细胞进行生物循环研究系统的研究

基本信息

批准号：
22890147
负责人：
齋藤陽子
金额：
$ 1.91万
依托单位：
Kagoshima University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
财政年份：
2010
资助国家：
日本
起止时间：
2010 至 2011
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22890147/
关键词：
再生医学バイオリサイクル歯 iPS細胞

项目摘要

本研究は過剰歯歯髄からiPS細胞を樹立することを目的に、平成22年度に遺伝子導入のためのプラスミドの増幅を行った。続いて患者から採取した過剰埋伏歯の歯髄細胞を、コラゲナーゼを用いて初代培養し、30日間培養維持した。また、iPS細胞樹立に必要不可欠なFeeder細胞に関し、複数の異なる薬物耐性を持つFeeder細胞の樹立を試みた。CMVプロモータ下にHygromycin、Puromycin、NeomycinのいずれかとBleomycinの2種類の薬剤耐性遺伝子を持つプラスミドを作成しこれら3つのプラスミドを、それぞれSTO細胞へリポフェクション法にて遺伝子導入を行った。遺伝子導入後より2種類の薬剤にて遺伝子導入細胞の選択を行い、2か月間薬剤投与を続けた。樹立した細胞のES細胞未分化維持能を評価するため、Mitomycin C処理した樹立細胞上にて、muse ES細胞を播種・培養し、継代後のES細胞の形態学的変化について評価を行った。薬剤投与にて選別された、Hygromycin/Bleomycin耐性STO細胞(SHB細胞)、Puromycin/Bleomycin耐性STO細胞(SPB細胞)、Neomycin/Bleomycin耐性STO細胞(SNB細胞)を樹立した。いずれの細胞もSTO細胞とほぼ同じ細胞形態をしており、長期間培養維持が可能(18継代まで確認)であった。また、樹立細胞上に播種されたES細胞については、形態学的には変化は認められず、良好な継代維持が可能であった。平成23年度には上記の手法を組み合わせ、過剰歯歯髄からiPS細胞を樹立するための直接的な実験を開始したが、本研究をベースとした研究が若手研究(B)に採用となり、本研究の廃止申請に至った。

这项研究在2010年扩增了基因转移的质粒，目的是从多余的纸浆中建立IPS细胞。随后，使用胶原酶培养了从患者那里收集的过多牙齿的纸浆细胞，并维持30天。此外，我们试图建立具有多种不同耐药性的进料细胞，这对于建立IPS细胞至关重要。在CMV启动子下制备了具有两种类型的耐药性基因的质粒，即湿霉素，紫霉素，新霉素和博来霉素，并使用Lipofection方法将这三个质粒转染到STO细胞中。基因转移后，使用两种类型的药物选择细胞，并给予药物两个月。为了评估在已建立的细胞中维持ES细胞未分化的能力，将Muse ES细胞接种并在用丝霉素C处理的已建立细胞上培养，并在通过后评估ES细胞的形态变化。建立了由药物给药选择的综合霉素/抗霉素耐药性Sto细胞（SHB细胞），纯霉素/博霉素耐药性Sto细胞（SPB细胞）和新霉素/博来霉素耐药性Sto细胞（SNB细胞）。所有细胞的细胞形态与Sto细胞的形态几乎相同，从而可以长期维持培养物（已确认为18）。此外，未观察到在已建立细胞上的ES细胞的形态变化，从而可以良好地传递。在2011年，我们开始了一个直接的实验，以结合上述方法以从过量的纸浆中建立IPS细胞，但是对年轻研究人员（B）采用了基于这项研究的研究，从而导致了废除这项研究的申请。