単層無血清培養系での鎖骨頭蓋異形成症歯髄由来iPS細胞の樹立および細胞特性解析

单层无血清培养系统中锁骨颅骨发育不良牙髓来源 iPS 细胞的建立和细胞表征

• 批准号: 26893168
• 负责人: 向笠 英恵
• 金额: $ 1.75万
• 依托单位: Hiroshima University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Research Activity Start-up
• 财政年份: 2014
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2014-08-29 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-26893168/
• 关键词: ヒトiPS細胞; 無血清培養; 鎖骨頭蓋異形成症; 歯髄

1．CCD患者からフィーダー細胞を用いない単層無血清培養系でCCD-iPS細胞株を樹立鎖骨頭蓋異形成症（CCD）患者歯髄細胞（DPC）に初期化4遺伝子を導入後、19日後よりiPS細胞様コロニーの出現を認めた。無血清培地hESF9培地を用いて継代維持を行った。ALP陽性コロニーをカウントしたところ、60mm dishでは1.74%、100mm dishでは0.25％と高い誘導効率を示した。2．CCD-iPS細胞の未分化能および多分化能解析RT-PCR解析および蛍光免疫染色法にて未分化能を維持していた。骨分化誘導後のAlizarin Red染色およびAlkaline Phosphatase染色では、control（DPC-iPSおよびTic）と比較してCCD-iPSでは染色強度が著しく低下していた。ddPCR解析により、CCD-iPSはDPC-iPSと比較し、Runx2などの骨分化マーカー遺伝子の発現が低下していた。軟骨分化誘導後Alcian Blue & PAS染色を行ったところ、controlと比較してAlcian Blue陽性細胞数が低下していた。ddPCR解析により、CCD-iPSはcontrolと比較し、Runx2などの軟骨分化マーカー遺伝子の発現が低下していた。本研究の結果、遺伝性疾患であるCCD由来DPCよりフィーダー細胞を用いない単層無血清培養系を用いてCCD-iPS細胞の誘導・樹立に成功した。CCD-iPS細胞は、未分化性と多分化能を有しており、骨・軟骨分化誘導時に疾患個体で認められる各種分化マーカー遺伝子や蛋白の発現低下を示したことから、CCDの病態を反映する疾患特異的細胞モデルとして有用であると考えられた。本培養系を用いて、CCDを含めた種々の遺伝性疾患特異的iPS細胞を樹立することで、病態解明や治療法の開発に寄与すると考えられた。

1. CCD-iPS cell lines were established in single-layer serum-free culture system of CCD patients. The initial 4-gene expression was detected in DPC cells of CCD patients after 19 days of introduction. Serum-free culture hESF9 ALP positive rate is 1.74% for 60mm dish and 0.25% for 100mm dish. 2. The undifferentiated and pluridifferentiated ability of CCD-iPS cells was analyzed by RT-PCR and maintained by light immunostaining. Alizarin Red staining and Alkaline Phosphatase staining after induction of bone differentiation were lower than those of control (DPC-iPS) and CCD-iPS staining. In ddPCR analysis, compared with CCD-iPS and DPC-iPS, the discovery of bone differentiation Alcian Blue & PAS staining was performed after cartilage differentiation induction, and the number of Alcian Blue positive cells decreased compared with control. ddPCR analysis, CCD-iPS control, Runx2, cartilage differentiation, gene development, low level The results of this study indicate that CCD-iPS cells have been successfully induced and established in single-layer serum-free culture lines. CCD-iPS cells are undifferentiated and multi-differentiated, and when bone and cartilage differentiation is induced, the individual with the disease recognizes that the expression of various differentiated proteins is low, and the disease reflects the disease-specific cells. This culture system contains a variety of disease-specific iPS cells for the development of disease therapy.