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定量的生体分子イメージング・操作法の開発

定量生物分子成像和操作方法的发展

基本信息

批准号：
26248036
负责人：
小澤岳昌
金额：
$ 9.82万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (A)
财政年份：
2014
资助国家：
日本
起止时间：
2014-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-26248036/
关键词：
生体分析イメージング蛍光リン酸化 GPCR

项目摘要

課題１：生細胞内ではたらく小数分子の可視化・定量法では，細胞内在性のテロメアRNAを1分子レベルで可視化し，その数を計測する新たな技術を開発した．RNA結合タンパク質の一つPumilio (PUM1)にアミノ酸変異を加え，UUAGGGUUを特異的に認識するように分子設計した．生細胞内にプローブを発現させ，全反射蛍光顕微鏡で細胞核内のテロメアRNAを１分子レベルで観測することに成功した．課題２：光によるリン酸化酵素活性の制御法では，細胞内キナーゼ（Akt）活性光操作法を開発した．CRY2にはAktを，CIB１のN末側ドメイン（CIBN）には膜局在化シグナル(Myr)を連結した．光照射すると， CRY2に融合したAktは細胞膜に局在し，Aktの基質タンパク質をリン酸化することを実証した．光強度，照射時間を変え，膜への移行速度，および膜からの解離速度を定量的に解析した．ウエスタンブロッティング法および逆転写PCRによって，光依存的に細胞膜に移行したCRY2-Aktの活性化を評価した．基質タンパク質の１つであるNO合成酵素(eNOS)が光照射回数依存的にリン酸化されること，またAktの下流で制御されているAtrogin遺伝子発現が抑制されることを実証した．課題３：Gタンパク質共役受容体（GPCR）活性の評価法と制御分子の探索では，分割ルシフェラーゼの再構成法”を展開し，GPCRーβarrestin相互作用の高感度検出システムを開発した．重症薬疹の原因リセプターをターゲットとし，化合物ライブラリースクリーニング用細胞の樹立に成功した．

Topic 1: the molecular design of the molecular design of UUAGGGUU is based on the quantification of decimal molecules, the quantification of RNA, the calculation of the number of molecules, the introduction of new technologies, the addition of RNA, the addition of Pumilio (PUM1), and the molecular design of the molecular design of DNA. The total reflection photospectrophotometer showed that the RNA molecule in the nucleus was activated successfully. Topic 2: photosensitizer acidifying enzyme activity control method, Akt active light operation method to open the photoperiod. CRY2 photoluminescence Akt, CIB1 N terminal photoluminescence (CIBN) thin film bureau in the chemical reaction temperature (Myr) contact contact assay. The CRY2 fusion Akt cell membrane is in place, and the Akt substrate is acidified and acidified. The light intensity, exposure time, membrane migration velocity, and membrane temperature release rate are quantified by the analytical method of reverse writing of PCR. Light-dependent cell membrane migration, CRY2-Akt activation, NO synthesis enzyme (eNOS), number-dependent acidification. In order to control the activity of common service capacitor (GPCR), to control the molecular exploration of Akt, the method of controlling the activity of common service capacitor (GPCR) was used to control the molecular exploration, and the method of dividing the drug was used to reconstruct the method. The GPCR-β-arrestin interaction was highly sensitive. The cause of severe rash was severe. The cause of severe rash was cold, and the compound was isolated successfully.