定量的生体分子イメージング・操作法の開発

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課題１：生細胞内ではたらく小数分子の可視化・定量法では，細胞内在性のテロメアRNAを1分子レベルで可視化し，その数を計測する新たな技術を開発した．RNA結合タンパク質の一つPumilio (PUM1)にアミノ酸変異を加え，UUAGGGUUを特異的に認識するように分子設計した．生細胞内にプローブを発現させ，全反射蛍光顕微鏡で細胞核内のテロメアRNAを１分子レベルで観測することに成功した．課題２：光によるリン酸化酵素活性の制御法では，細胞内キナーゼ（Akt）活性光操作法を開発した．CRY2にはAktを，CIB１のN末側ドメイン（CIBN）には膜局在化シグナル(Myr)を連結した．光照射すると， CRY2に融合したAktは細胞膜に局在し，Aktの基質タンパク質をリン酸化することを実証した．光強度，照射時間を変え，膜への移行速度，および膜からの解離速度を定量的に解析した．ウエスタンブロッティング法および逆転写PCRによって，光依存的に細胞膜に移行したCRY2-Aktの活性化を評価した．基質タンパク質の１つであるNO合成酵素(eNOS)が光照射回数依存的にリン酸化されること，またAktの下流で制御されているAtrogin遺伝子発現が抑制されることを実証した．課題３：Gタンパク質共役受容体（GPCR）活性の評価法と制御分子の探索では，分割ルシフェラーゼの再構成法”を展開し，GPCRーβarrestin相互作用の高感度検出システムを開発した．重症薬疹の原因リセプターをターゲットとし，化合物ライブラリースクリーニング用細胞の樹立に成功した．