プロテインスプライシング反応を利用した機能性プローブ分子の開発と応用

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1)生きた細胞内におけるタンパク質の核内移行検出プローブを開発した.311アミノ酸からなるrenilla luciferase (RLuc)のN末から229番目で切断すると,splitしたRLucがプロテインスプライシングにより効率よく再構成されることを見出した.このsplit RLucを用いて,glucocorticoid receptor (GR)の核内移行検出法を開発した.マウスがストレスを感受した時に分泌されるcorticosteroneを,マウス個体非侵襲的にイメージングできることを実証した.さらに,STAT3タンパク質のリン酸化やコレステロール濃度変化によるタンパク質核内移行検出法を開発し,プローブの広範な応用可能性であることを実証した.2)Smac/DIABLOタンパク質から,ミトコンドリア膜間腔(IMS)局在シグナル配列を同定した.IMSに局在するSmacタンパク質にランダムにミューテーションを加え,IMS局在に重要なアミノ酸を同定した.その結果,Smacのミトコンドリアシグナル配列にAVPIの4アミノ酸を付加した配列が,IMSシグナル配列として機能することを明らかにした.このシグナルペプチドに蛍光プローブやaffinity tagを連結し,プローブやaffinity tagがIMSにtargetingさせることが可能であることを実証した(投稿中).3)細胞膜上のタンパク質間相互作用を検出するために,splitした核内転写因子(mLexA-VP16)の再構成に基づくreporter gene assay法を開発した.EGF刺激により誘起されるRasとRaf-1との相互作用を,luciferaseをレポーターとして検出することに成功した.Two-hybridなどの従来法と比較し,高感度検出が可能であることを実証した.