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タンパク質立体構造情報に基づく生物発光プローブの開発

基于蛋白质3D结构信息的生物发光探针的开发

基本信息

批准号：
18038042
负责人：
小澤岳昌
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Institute for Molecular Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18038042/
关键词：
可視化バイオテクノロジー生体分子

项目摘要

ペプチド切断酵素(Caspase)の活性化プローブを開発した.Firefly luciferaseのN末端とC末端をプロテインスプライシングで連結した、カン状luciferaseを新たにデザインし、caspase-3検出プローブとした。COS7細胞にカン状luciferaseを発現させ、アポトーシスシグナルに伴う発光シグナル変化を評価した。Caspase不活性な状態では、1wellの培養細胞(1x10^5細胞)から単位時間(1min)あたりの発光(background発光)が〜10,000au/min、かつ細胞内caspaseが活性化した時にbackground発光の約10倍(100,000au/min)の発光強度変化が起こるプローブを開発した。阻害剤の一つZ-VAD-FMKを用いて、caspase-3の阻害活性を定量的に評価できるアッセイ系を確立した。またマウス個体内でのcaspase-3活性を時間変化をおって検出できることを示した(投稿中).タンパク質のリン酸化検出プローブを開発した.骨形成因子(BMP)シグナルの下流でリン酸化を受けるSmadタンパク質のリン酸化を,luciferaseの発光により検出するプローブを開発した.独自の技術であるスプリットluciferaseにSmad1とSmad4タンパク質を連結した.Smadを恒常的にリン酸化するALKリセプターを発現したCOS7細胞からは,Smadのリン酸化に伴うluciferaseの強い発光が観察された.また開発したプローブをカエルの初期胚に発現させ,カエル卵の初期発生段階におけるSmadのリン酸化を,リアルタイムにイメージングできることを明らかにした.

The Caspase is activated and the Firefly luciferase is activated. The N-terminal of the caspase-3 is the C-terminal, the C-terminal, the second, the second. The COS7 cell is in the shape of a luciferase. It is not clear that it is in the presence of light. Caspase inactive cell, 1well cell (1x10 ^ 5 cell) cycle time (1min) phosphorescent light (background light) 10000au/min, temperature intracellular caspase inactive phosphor background phosphor about 10 times (100000au/min) the intensity of light intensity turns on and off. The quantitative determination of the inhibitory activity of Z-VAD-FMK was determined by the quantitative measurement of the inhibitory activity of the enzyme and caspase-3. Two caspase-3 activity tests in vivo were used to determine the activity of caspase-3 (in contribution). In the process of acidification, it is necessary to start the process of acidification. The bone morphogenetic factor (BMP) was acidified by Smad phosphorylation and luciferase photoluminescence. On your own, you can use your own technology to help you luciferase your Smad1, Smad4 your computer, connect to your computer. Smad's constant acidizing effect on ALK shows that the COS7 cells are fine, while Smad on acidizing is accompanied by a strong photosensitive response on luciferase. During the first half of the pregnancy, the embryo developed in the early stage of the pregnancy, and the Smad was acidified in the early stage of the ovum.