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タンパク質立体構造情報に基づく生物発光プローブの開発

基于蛋白质3D结构信息的生物发光探针的开发

基本信息

批准号：
18038042
负责人：
小澤岳昌
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Institute for Molecular Science
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-18038042/
关键词：
可視化バイオテクノロジー生体分子

项目摘要

ペプチド切断酵素(Caspase)の活性化プローブを開発した.Firefly luciferaseのN末端とC末端をプロテインスプライシングで連結した、カン状luciferaseを新たにデザインし、caspase-3検出プローブとした。COS7細胞にカン状luciferaseを発現させ、アポトーシスシグナルに伴う発光シグナル変化を評価した。Caspase不活性な状態では、1wellの培養細胞(1x10^5細胞)から単位時間(1min)あたりの発光(background発光)が〜10,000au/min、かつ細胞内caspaseが活性化した時にbackground発光の約10倍(100,000au/min)の発光強度変化が起こるプローブを開発した。阻害剤の一つZ-VAD-FMKを用いて、caspase-3の阻害活性を定量的に評価できるアッセイ系を確立した。またマウス個体内でのcaspase-3活性を時間変化をおって検出できることを示した(投稿中).タンパク質のリン酸化検出プローブを開発した.骨形成因子(BMP)シグナルの下流でリン酸化を受けるSmadタンパク質のリン酸化を,luciferaseの発光により検出するプローブを開発した.独自の技術であるスプリットluciferaseにSmad1とSmad4タンパク質を連結した.Smadを恒常的にリン酸化するALKリセプターを発現したCOS7細胞からは,Smadのリン酸化に伴うluciferaseの強い発光が観察された.また開発したプローブをカエルの初期胚に発現させ,カエル卵の初期発生段階におけるSmadのリン酸化を,リアルタイムにイメージングできることを明らかにした.

Caspase-3 is a new enzyme that can be activated and linked to the N-terminal and C-terminal ends of Firefly luciferase. COS7 cells were evaluated for the development of cytosine kinase and its association with cytosine kinase. 1well of cultured cells (1x10^5 cells) starts to emit light at a single time (1min) or at a background light intensity of ~ 10,000 au/min, and starts to emit light at a background light intensity of about 10 times (100,000 au/min) when intracellular caspase is activated. A quantitative evaluation of the protective activity of caspase-3 using Z-VAD-FMK inhibitors was established. Caspase-3 activity changes with time in vivo. The quality of the product is very high. Bone morphogenetic factor (BMP) gene expression in the lower reaches of the cell line is affected by Smad protein expression in the lower reaches of the cell line, and the expression of luciferase in the lower reaches of the cell line develops. Smad1, Smad4, Smad 6,Smad 7, Smad 7,Smad The first stage of development of the egg is the initial stage of development of the egg.