Research on the roles of neural crest derived cells in the pulmonary development .

本研究では、「肺における神経堤に由来する細胞が、外環境の酸素濃度を感知して、出生直後の肺胞形成およびその後の肺の恒常性維持に重要な役割を果たす」という仮説に対し、エンドセリン系を切り口として、分子遺伝学的手法やイメージング法を駆使して解明することを試みるものである。当該年度は下記3つのアプローチで研究を進めた。①シングルセルRNAシーケンス解析による肺胞形成、恒常性維持に重要なシグナルの同定：生後0.5日のET-2遺伝子欠損マウスと野生型マウスの肺から調製したRNAを用いて、シングルセルRNAシーケンスによる網羅的な解析を行った。その結果、ET-2の欠損により肺に活性化された好中球で構成される分画が新たに出現していることが明らかとなった。これらの細胞が出生直後の呼吸開始とともに出現したのかどうかを確認するために出生直前の胎児を帝王切開で取得し、調製した検体を用いてシングルセルRNAシーケンス解析を実施したところ、呼吸開始前から肺に活性化された好中球が出現していることが明らかとなった。②ET-2レポーターマウスの作出：ET-2の遺伝子座に超高輝度発光タンパクの機能を持つYeNL2.0-CL1-PEST遺伝子をノックインしたマウスをCRISPER/Cas9システムを用いて作出した。マウスは発生学的な異常をきたさず発育しており、生体イメージングの手法を用いてET-2の発現を確認する。③モデル動物を用いたアプローチ：野生型マウスを用いてエラスターゼで処置した慢性閉塞性肺疾患（COPD）のモデルマウスの作成を試みた。フレキシベントを用いた呼吸機能検査および肺の組織学的解析でCOPDを誘発できていることを確認した。

本研究では、「肺における神経堤に由来する細胞が、外環境の酸素濃度を感知して、出生直後の肺胞形成およびその後の肺の恒常性維持に重要な役割を果たす」という仮説に対し、エンドセリン系を切り口として、分子遺伝学的手法やイメージング法を駆使して解明することを試みるものである。当該年度は下記3つのアプローチで研究を進めた。①シングルセルRNAシーケンス解析による肺胞形成、恒常性維持に重要なシグナルの同定：生後0.5日のET-2遺伝子欠損マウスと野生型マウスの肺から調製したRNAを用いて、シングルセルRNAシーケンスによる網羅的な解析を行った。その結果、ET-2の欠損により肺に活性化された好中球で構成される分画が新たに出現していることが明らかとなった。これらの細胞が出生直後の呼吸開始とともに出現したのかどうかを確認するために出生直前の胎児を帝王切開で取得し、調製した検体を用いてシングルセルRNAシーケンス解析を実施したところ、呼吸開始前から肺に活性化された好中球が出現していることが明らかとなった。②ET-2レポーターマウスの作出：ET-2の遺伝子座に超高輝度発光タンパクの機能を持つYeNL2.0-CL1-PEST遺伝子をノックインしたマウスをCRISPER/Cas9システムを用いて作出した。マウスは発生学的な異常をきたさず発育しており、生体イメージングの手法を用いてET-2の発現を確認する。③モデル動物を用いたアプローチ：野生型マウスを用いてエラスターゼで処置した慢性閉塞性肺疾患（COPD）のモデルマウスの作成を試みた。フレキシベントを用いた呼吸機能検査および肺の組織学的解析でCOPDを誘発できていることを確認した。