Epigenetic regulation of multipotency in salivary gland stem cells

当該研究で利用する解析システムはChromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC（10xGENOMICS）システムである。本システムの特徴は、細胞から単離した核からDNA およびRNAを抽出し、DNA はscATACseq にRNA はscRNAseq解析にそれぞれ利用される。一方、10xGENOMICSはこれまでMultiome解析に必要な基盤技術を報告しているが、唾液腺組織に関する核単離方法に関する詳細な報告はなされていない。そこで、当該年度では、Chromium Nuclei Isolation Kit（10xGENOMICS）のプロトコールを基本に、胎生期唾液線から解析に必要なQualityの核単離条件を検討した。まず、本システムで最低必要となる細胞数1,000,000細胞を採取するために必要な胎生期マウスの必要数を検討した。すなわち、胎生13.5日の胎仔マウスから両側の顎下腺を摘出し、摘出した唾液腺をヒアルロニダーゼとコラゲナーゼで処理後、Trypleにて細胞を分散化し細胞数を計測した。その結果、唾液腺あたり約100,000細胞の採取が可能なことが明らかとなった。当該研究で必要とされる胎生16日および生後8週齢マウスの唾液腺から採取できる細胞数も同様にカウントし、胎生13.5日唾液腺は、妊娠マウス2腹、胎生16日唾液腺は1腹、および生後8週齢のマウスは1匹となることが明らかとなった。次に、これらのマウスより唾液腺をそれぞれ採取し、液体窒素で凍結し180℃の冷蔵庫で保存した。さらに、Chromium Nuclei Isolation Kitを用いて核を単離し、細胞数のカウントと位相差顕微鏡を用いて単離核のQuality を評価する事により核抽出の条件を検討し、その再現性について確認している。

当該研究で利用する解析システムはChromium Next GEM Single Cell Multiome ATAC（10xGENOMICS）システムである。本システムの特徴は、細胞から単離した核からDNA およびRNAを抽出し、DNA はscATACseq にRNA はscRNAseq解析にそれぞれ利用される。一方、10xGENOMICSはこれまでMultiome解析に必要な基盤技術を報告しているが、唾液腺組織に関する核単離方法に関する詳細な報告はなされていない。そこで、当該年度では、Chromium Nuclei Isolation Kit（10xGENOMICS）のプロトコールを基本に、胎生期唾液線から解析に必要なQualityの核単離条件を検討した。まず、本システムで最低必要となる細胞数1,000,000細胞を採取するために必要な胎生期マウスの必要数を検討した。すなわち、胎生13.5日の胎仔マウスから両側の顎下腺を摘出し、摘出した唾液腺をヒアルロニダーゼとコラゲナーゼで処理後、Trypleにて細胞を分散化し細胞数を計測した。その結果、唾液腺あたり約100,000細胞の採取が可能なことが明らかとなった。当該研究で必要とされる胎生16日および生後8週齢マウスの唾液腺から採取できる細胞数も同様にカウントし、胎生13.5日唾液腺は、妊娠マウス2腹、胎生16日唾液腺は1腹、および生後8週齢のマウスは1匹となることが明らかとなった。次に、これらのマウスより唾液腺をそれぞれ採取し、液体窒素で凍結し180℃の冷蔵庫で保存した。さらに、Chromium Nuclei Isolation Kitを用いて核を単離し、細胞数のカウントと位相差顕微鏡を用いて単離核のQuality を評価する事により核抽出の条件を検討し、その再現性について確認している。