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時分割ラウエ法によるリボヌクレアーゼRhの立体構造と反応機構の解明

利用时间分辨劳厄法阐明核糖核酸酶Rh的三维结构和反应机制

基本信息

批准号：
05244211
负责人：
中村和郎
金额：
$ 1.22万
依托单位：
Showa University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-05244211/
关键词：
ラウエ法時分割リボヌクレアーゼ立体構造酵素反応機構

项目摘要

【.encircled1.】遺伝子工学的に得たリボヌクレアーゼRh(RNase RNAP-Rhと略)の結晶化を行い、X線回折実験に適した結晶を得て、既に得られているRNase Rhの原子座標を使用し、分子置換法によって結晶構造解析に成功した。さらに、結晶中に阻害剤(2'-AMP,3'-AMPその他)や基質類似体(dApG)を浸漬して、基質の結合様式、反応機構を明らかにする研究も行い、得られた分子モデルから、基質であるヌクレオチドの塩基はTrp49およびTyr57の2つの側鎖環によってサンドイッチされ、かつAsp51と2本の水素結合により結びつけられていることが判明した。また、基質類似体等のリン酸基はHis46,His109,His108,His104,Glu105付近に存在していることが分かり、触媒反応機構を明らかにする努力を現在進めている。【.encircled2.】RNase RNAP-Rhの部位特異的改変体の解析は、何種類か試みたが、現在のところTyr57の改変体(Y57W)が結晶化し、その解析に成功している。Y57Wは、5'側にプリン塩基をもつジヌクレオチドモノリン酸(ApX,GpX)に対する活性が2倍になるという報告があるが、モデルから、これはTyrからTrpに置き換わったことによるスタッキング能の向上に基づくものであると結論づけられた。【.encircled3.】時分割ラウエ法を用いて、本酵素の反応機構を動的に解析する可能性を目指して、本年度はその解析の準備を始めた。まず、ラウエ法の回折データ収集手順を学ぶ意味でHEWリゾチームを使用して予備実験を行った。ついで、平成6年3月にRNase RNAP-Rhの結晶を使用してラウエ法によるデータ収集を行う予定である。

【.encircled1.】に德たリボヌクレアーゼRh(RNase RNAP-Rh ととととのcrystallization was carried out, X-ray refractory crystallization was carried out, the atomic coordinates of RNase Rh were used, and the molecular replacement method was used to analyze the crystal structure successfully.さらに, crystallized blocking agent (2'-AMP, 3'-AMP そのTA) and matrix analog (dApG)をImpregnation, matrix binding method, reaction mechanism を明らかにする research も行い, られたmolecule モデルから, matrix であるヌクレオチドの塩基はTrp49およびTyr57の2つのside locking ring によってサンドイッチされ、かつAsp51と2本のhydrogen combined により knot びつけられていることが clarified した. His46, His109, His108, His104, Gl U105 is close to existence, and the catalytic reaction agency is working hard, and it is now entering. 【.encircled2.】RNase RNAP-Rh site-specific modification analysis, what type of test, now Tyr57 modification (Y57W) crystallization, and analysis success. Y57Wは, 5' side sewage treatment base Acid (ApX, GpX) activity is 2 times the activity of acid (ApX, GpX) reportが、モデルから、これはTyrからTrpに屋きchangeわったことによるスタッキング能の上に记づくものであると Conclusion づけられた. 【.encircled3.】The time division method is used, the reaction mechanism of the enzyme is analyzed, the possibility is analyzed, and the preparation for the analysis of this year is started.まず、ラウエ法のturnback データCollect hand shun を学ぶmeaning でHEWリゾチームを Use してyuprep実験を行った.ついで, RNase RNAP-Rh crystals were collected in March 2006 using the してラウエ method and were collected and determined.