リボヌクレアーゼの立体構造と活性の相関の進化論的研究

核糖核酸酶三维结构与活性关系的进化研究

• 批准号: 61580131
• 负责人: 中村 和郎
• 金额: $ 0.7万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for General Scientific Research (C)
• 财政年份: 1986
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1986 至 1987
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-61580131/
• 关键词: リボヌクレアーゼ; 酵素; 蛋白質工学; 立体構造; X線解析; 一次構造; タンパク質の結晶化; 酵素の一次構造; X線構造解析

1)昨年度の実績報告書にも記したように, リボヌクレアーゼRhの結晶化は成功し, 今年度は本格的な結晶構造解析を目指して, 回折強度データの収集を開始し, Native結晶の非常に良好な回折データ(Rsym<2%)を得ることができた.2)引続き, 重原子同型置換体の探索を開始し, 多数の試薬溶液に浸漬した後, 回折実験を行った結果, 3種類の試薬が有効な重原子同型置換体を与え得ることを発見した. その中の2つK_2Pt(SCN)4, K_2PtCl_4置換体の回折データを, 4軸自動回折系を用いて収集することができた. これらのデータとNativeデータとの差のパターソン関数を計算して, 解析のキーポイントとなる重原子の位置の決定を試みた.3)その結果, 前者の置換体について, その解釈が現在成功しつつあり, 最小2乗法による位置の精密化を開始し, 良好な結果が得られつつある. もう一つの置換体の重原子位置の決定ができるか, 異常分散効果を利用すると, 電子密度図を得ることができ, 立体構造の決定につながっていく.4)Rhの一次構造は, 入江らによって, 従来法と遺伝子工学的手法をあわせることによって, 完全に決定された. その結果から, RNase T_2やMとのホモロジーは高く(T_2とは65%の相同性あり), また10個存在するCys残基はすべて保存されており, さらにHis46とHis109(活性に関与されているとされている)も保存されている. これらより, Rhの構造は, これらグループの代表となるものであり, 構造決定の重要性はさらに増したといえる. また, Site directed Mutagenesisによる酵素も使った, X線解析も, このリボヌクレアーゼRhに対して行えるようになった.

1)In the report of the annual results, it was noted that the crystallization of Rh was successful. This year, the crystal structure analysis of this type was pointed out. The collection of the reflection strength was started. The Native crystal was very good. The reflection quality (Rsym<2%) was obtained. The exploration of heavy atom isoform was started. After immersion in most of the test solutions, The results show that there are three kinds of heavy atom isoforms in the experiment. A 4-axis auto-folding system is proposed for the application of 2-K_(2) Pt (SCN)_4, K_(2) PtCl_(4) substitutants. The difference between this data and the Native data is calculated, and the determination of the position of the heavy atoms is analyzed carefully. 3) As a result, the former substitution is not solved, and the solution is now successful. The precision of the position in the minimum 2-inch method has begun, and good results have been achieved. The determination of heavy atom position of Rh substitution, the utilization of anomalous dispersion effect, the determination of electron density, the determination of three-dimensional structure, etc. 4) The primary structure of Rh is determined completely by the method of genetic engineering. As a result, RNase T_2 and M are highly conserved (T_2 and 65% identity), and 10 Cys residues are conserved. Therefore, the structure of Rh is the representative of Rh, and the importance of structural decisions is increasing. Site directed Mutagenesis, X-ray analysis, and the development of new technologies.

项目成果

栗原宏之: J.Biol.Chem.262. (1987)

栗原博之：J.Biol.Chem.262（1987）。

中村和郎: 日本結晶学会誌. 30. NO2 (1988)

中村一夫：日本晶体学会杂志 30. NO2 (1988)。

T.Nonaka, K.Nakamura, Y.Mitsui, M.Irie et al.: J.Mol.Biol.(1988)

T.Nonaka、K.Nakamura、Y.Mitsui、M.Irie 等：J.Mol.Biol.(1988)

中村和郎,飯高洋一: "結晶の分子科学入門 第5章第3節" 講談社サイエンティフィク, 236 (1988)

Kazuo Nakamura、Yoichi Iidaka：“晶体分子科学导论，第 5 章第 3 节”讲谈社科学，236 (1988)

H. Horiuchi, M. Irie, et al.: J.Biochem (Tokyo). (1988)

H. Horiuchi、M. Irie 等人：J.Biochem（东京）。