クライオ電顕を用いた時分割構造解析による破傷風毒素の膜侵入機構解明

使用冷冻电镜进行时间分辨结构分析，阐明破伤风毒素的膜侵袭机制

• 批准号: 22H02557
• 负责人: 井上 豪
• 金额: $ 10.98万
• 依托单位: Osaka University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 2022
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2022-04-01 至 2025-03-31
• 项目状态: 未结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/en/grant/KAKENHI-PROJECT-22H02557/
• 关键词: 破傷風毒素; クライオ電顕; ダイナミクス; 抗体複合体; 時分割解析; 低温トラップ; 構造変化

破傷風毒素（TeNT）は、同じClostridium属のボツリヌス毒素（BoNT）と細胞膜透過の分子機構が同一であるにも関わらず、BoNTが末梢神経系で作用するのに対してTeNTは中枢神経系のみで働くことが知られている。本申請では、還元型（不活性型）の破傷風毒素（TeNT）をクライオ電顕で用いるグリッドに固定化し、低pH下で酸化剤を添加して酸化型（活性型）へと構造変化させた場合の変化の過程を低温トラップ法で解析し、中枢神経系のみで膜侵入が起こる分子機構について考察することを目的としている。本目的を達成するためには、令和３年度に導入したクライオ電顕を稼働させる必要があり、令和４年度はそのほぼ全てのエフォートを装置の立ち上げに注力した。測定装置の制御装置の部品交換をしたり、１つ１つ原因を検討してはそれを確認したりする作業を繰り返しながら測定装置の立ち上げを行った結果、令和４年度の年度末に入ってから漸く装置が稼働しはじめ、不安定ながらもTEM画像の連続撮影が可能となる場面が徐々に増えてきた。一方で他の測定装置を用いてグラフェンを酸化し、エポキシ基を導入したクライオ電顕用の新規グリッド（EG-Grid）を開発し、グラフェン膜上にタンパク質を固定化して効率よく構造解析が可能となることを実証し、欧文雑誌に投稿し受理された（Fujita, J. et al., Scientific Reports, 2023)。実際のEG-Grid上に破傷風毒素(TeNT)を固定化し、それに反応溶液を混合してから凍結するまでの時間を調節して構造変化を追う作業は令和５年度に持ち越すこととした。

Tetanus toxin (TeNT) は, with じ Clostridium is の ボ ツ リ ヌ ス toxin (BoNT) と membrane through の molecular が same で あ る に も masato わ ら ず, BoNT が endings god 経 department role で す る の に し seaborne て TeNT は central 経 god is の み で 働 く こ と が know ら れ て い る. This application で は, also yuan (inactive) の tetanus toxin (TeNT) を ク ラ イ オ electric 顕 で with い る グ リ ッ ド に immobilized し, で acidification under low pH tonic を add し て acidification type (activity type) へ と structure - the さ せ た occasions の の - process を cryogenic ト ラ ッ プ method で し, central department of god 経 の み で membrane invades が up こ る molecular institutions に つ Youdaoplaceholder0 て examination する とを とを purpose と と て る る る. This purpose を reached す る た め に は, make and 3 year に import し た ク ラ イ オ electric 顕 を grain 働 さ せ る necessary が あ り, make and 4 year は そ の ほ ぼ full て の エ フ ォ ー ト を device の made ち げ に note force し た. Measurement device の suppression device の part exchange を し た り, つ 1 つ を beg し 検 て は そ れ を confirm し た り す る homework を Qiao り return し な が ら measurement device の made ち げ を line っ た results, and at the end of the 4 year の year に into っ て か ら gradually く device が grain 働 し は じ め, unrest な が ら も TEM picture の may even 続 pinch of shadow が と な る scenes が Xu 々に zeng えて た た. Side で he の を measurement device with い て グ ラ フ ェ ン を acidification し, エ ポ キ シ base を import し た ク ラ イ オ electricity 顕 use の new rules グ リ ッ ド (EG - Grid) を open 発 し, グ ラ フ ェ ン membrane に タ ン パ ク qualitative を immobilized し て sharper rate よ く structure が may と な る こ と を be し, Owen 雑 volunteers contribute に し accept さ れ た (Fujit a, J. et al., Scientific Reports, 2023. Be interstate の EG - に tetanus toxin (TeNT) on the Grid を immobilized し, そ れ に anti を 応 solution mixed し て か ら freeze す る ま で を の time adjust し て structure - を chase う homework は make and 5 year に hold the more ち す こ と と し た.

项目成果

Immobilization of β-cyclodextrin onto polypropylene nonwoven fabric based on photooxidative surface modification

基于光氧化表面改性的β-环糊精在聚丙烯非织造布上的固定化

• DOI: 10.1038/s41428-022-00751-8
• 发表时间: 2023
• 期刊: Polymer Journal
• 影响因子: 2.8
• 作者: Yamamoto Keita;Asahara Haruyasu;Moriguchi Maiko;Inoue Tsuyoshi
• 通讯作者: Inoue Tsuyoshi

クライオ電子顕微鏡ハンドブック

冷冻电子显微镜手册

• 发表时间: 2023
• 作者: Segawa Katsumori;21人;Nagata Shigekazu;渡部 聡 稲葉 謙次
• 通讯作者: 渡部 聡 稲葉 謙次

グラフェングリッド、グラフェングリッドの製造方法、構造解析対象物質の構造解析方法

石墨烯网格、石墨烯网格制造方法、结构分析靶材料的结构分析方法

• 发表时间: 2023

除菌・消臭剤MA-Tの酸化制御技術を活用したクライオ電顕のツールの開発

利用消毒剂/除臭剂MA-T的氧化控制技术开发冷冻电镜工具

• 发表时间: 2022
• 作者: Koutsogiannaki Sophia;Bu Weiming;Maisat Wiriya;Manzor Mariel;Zhang Zhikuan;Ohto Umeharu;Eckenhoff Roderic G.;Yuki Koichi;井上豪
• 通讯作者: 井上豪

除菌消臭剤MA-Tのメカニズム解明に基づく酸化制御技術の開発とその応用

阐明消毒除臭剂MA-T机理的氧化控制技术开发及其应用

• 发表时间: 2022
• 作者: Koutsogiannaki Sophia;Bu Weiming;Maisat Wiriya;Manzor Mariel;Zhang Zhikuan;Ohto Umeharu;Eckenhoff Roderic G.;Yuki Koichi;井上豪;井上豪
• 通讯作者: 井上豪