硝酸イオンによる硝酸同化酵素の発現調節機構の解明

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硝酸還元酵素(NR)は硝酸イオンに応答して転写調節を受ける酵素としてよく知られている。しかしNR遺伝子上に存在すると予想される調節エレメントの決定は未だなされていない。この調節エレメントを明かにするためには、まずNRゲノム遺伝子を単離し、その構造を解析しなければならない。我々は既に昨年、硝酸イオンによりNRおよび亜硝酸還元酵素のmRNAの発現がみられない代謝制御変異株(I-1)を選抜している。そこで、野生株とI-1株のNRゲノム遺伝子の上流域の構造を比較することから、硝酸イオンに応答する調節エレメントを推定しようとした。本年はNRゲノム遺伝子を単離するため、ホウレンソウ培養細胞からNR遺伝子を含むDNA断片を用いてミニライブラリーを作製した。ゲノムDNAの調製法を検討した結果、4gのホウレンソウ培養細胞から比較的大きな(60-70kb)DNAを0.3mg回収することができた。得られたゲノムDNAを制限酵素EcoRIで切断後、ホウレンソウNRcDNAの5′側約1kbをプローブとしてゲノミックサザン解析を行った。その結果、約7kbの位置に強いシグナルが、5kbの位置に弱いシグナルが観察された。7kbのDNA断片にNRの5′上流領域が含まれるものと推定して、この断片をλZAPIIクローニングベクターのEcoRIサイトに組み込みライブラリーを作製した結果、組み換え体数約50万のNRゲノミックライブラリーを作製できた。現在このライブラリーからNRcDNAをプローブとしてNR遺伝子をスクリーニングしている。